c# free pdf viewer : Add page to pdf in preview control application system azure web page wpf console ratnerfull3-part808

Add page to pdf in preview - insert pages into PDF file in C#.net, ASP.NET, MVC, Ajax, WinForms, WPF
Guide C# Users to Insert (Empty) PDF Page or Pages from a Supported File Format
add multi page pdf to word document; adding page numbers to a pdf in preview
Add page to pdf in preview - VB.NET PDF Page Insert Library: insert pages into PDF file in vb.net, ASP.NET, MVC, Ajax, WinForms, WPF
Easy to Use VB.NET APIs to Add a New Blank Page to PDF Document
add page to pdf reader; add document to pdf pages
vaginalis as assessed by serial dilution and quantitative cultures (on streptomycin-containing HBT agar) of 
vaginal swabs collected in a standardized fashion (Fig. 5). This strategy appears to represent a marked 
improvement over prior animal models for G. vaginalis colonization, and will allow us to evaluate factors 
important in the establishment and maintenance of colonization. In addition, we have confirmed that we can 
isolate murine vaginal epithelial cells with a standardized swab technique (Fig. 5) in order to determine the 
current stage of estrus and to evaluate the presence of clue cells and other signs of BV. 
VLY domain 4 binds hCD59 and mediates 
species selectivity 
Mucosal epithelial cells sense bacterial pore-
forming toxins and can initiate immune signaling 
while bacterial densities remain low [61]. Purified 
VLY recapitulates the proinflammatory effects of 
whole G. vaginalis on epithelial cells (Fig. 6), 
raising the possibility that the VLY:hCD59 
interaction might be an important step in 
pathogenesis. The hCD59 receptor is expressed on 
the surface of human genital tract epithelial cells, 
the target cell type during G. vaginalis colonization 
and BV [62]. We hypothesized that VLYD4 was 
required for hCD59 binding. Using overlap-
extension PCR, we generated a toxin chimera, 
containing domains 1-3 of VLY and domain 4 of 
, a non-species-selective CDC. Unlike the 
parent VLY, the VLY:PLYD4 chimera lysed human 
and non-human cells with equal efficacy (Fig. 6). 
This result indicates that D4 plays a major role in 
species-selectivity among the CDCs.  
hCD59 signaling initiates plasma membrane 
blebbing In order to generate a probe for studies of 
toxin-hCD59 interactions, we created a 
GFP:VLYD4 fusion protein
. This protein binds to hCD59-expressing human epithelial cells but does not form 
pores and is a valuable tool for studies of hCD59-specific responses. Ligation of epithelial hCD59 by native 
VLY, hCD59 antibody, or GFP:VLYD4 fusion protein rapidly induces membrane blebbing (Fig. 6). Blebs 
remain intact and present over the course of hours prior to resolution. We hypothesize that this observation 
reflects a unique response of host cells to hCD59-dependent signaling pathways. Bleb formation represents a 
potential means for removal of toxin from the surface of epithelial cells and is a previously uncharacterized host 
response to bacterial toxins. Because bleb formation may also lead to removal of hCD59 from the cell surface, 
we will test the hypothesis that this mechanism sensitizes epithelial cells to lysis from autologous complement.  
VLY antiserum and toxoids inhibit cytolysis  In light 
of our findings of the importance of VLY to G. vaginalis-
mediated cytotoxicity and host responses, we explored 
methods to inhibit the VLY:hCD59 interaction. Rabbit 
polyclonal antiserum against VLY efficiently protects 
human erythrocytes from VLY-mediated lysis (Fig. 7). 
We also generated a genetic toxoid of VLY, 
VLY(V471R/K473C/P480W) by repeated rounds of site-
directed mutagenesis. This toxoid, which has CDC 
consensus residues restored for 3 amino acids in D4, 
does not cause lysis of human cells. However, it can 
interfere with ILY-mediated lysis of human erythrocytes (Fig. 7). Interference may occur by binding to (and 
occupying) the hCD59 receptor or by forming non-functional hetero-oligomers with ILY. We will investigate 
both antibody and toxoids as VLY inhibitors in Aim 2. 
Fig. 6VLYD4 and host cell responses. (A) Purified VLY and whole G. 
vaginalis induce expression of c-fos and phosphorylation of p38 MAPK and 
FAK-related non-kinase (FRNK). VLY induces maturation of IL-1β. (B
Human cervical epithelial cells express surface hCD59 (green). Nuclei 
(blue) and actin (red) shown for cellular architecture. (C) Homology model 
of VLY structure with D4 indicated.  (D) The VLY:PLYD4 chimera lyses 
human and equine erythrocytes, while native VLY is human-specific. (E
Exposure of human cervical epithelial cells to VLY (upper) or GFP:VLYD4 
(lower) induces rapid bleb formation. Co-localization of GFP:VLYD4 and 
bleb structure indicated at arrow. Membranes stained with wheat-germ 
agglutinin-Alexa Fluor 594 (red).  
Fig. 7Inhibition of the VLY:hCD59 interaction. (A) Polyclonal anti-
VLY antiserum but not control serum inhibits VLY-mediated cytolysis 
in a dose-dependent manner. (B) VLY toxoid inhibits ILY-mediated 
lysis of human erythrocytes. 
Research Strategy                                                                                             Page 35
Principal Investigator/Program Director (Last, first, middle): Ratner, Adam, Jonathan
C# WinForms Viewer: Load, View, Convert, Annotate and Edit PDF
PDF Annotation. • Add sticky notes to PDF document in preview. Add text to PDF document in preview. • Add text box to PDF file in preview.
add page to pdf without acrobat; add page numbers to a pdf file
C# WPF Viewer: Load, View, Convert, Annotate and Edit PDF
This page will mainly let you know: PDF Annotation. • Add sticky notes to PDF document. • Highlight PDF text in preview. • Add text to PDF document.
adding page numbers to a pdf in reader; add a page to a pdf online
Biofilm formation by G. vaginalis While the focus of this application is on 
the role of VLY in the pathogenesis of G. vaginalis, other virulence factors 
may also play a significant role. For example, G. vaginalis is known to form 
adherent biofilms in vivo [63]. Recent data suggest that even following 
targeted antimicrobial treatment, such biofilms can persist and likely 
contribute to the high recurrence rate of BV following treatment [64]. These 
effects can be modeled in vitro, as G. vaginalis forms biofilms on polystyrene, 
allowing quantification using a safranin-based assay (Fig. 8). In addition, 
fluorescent live-cell imaging of G. vaginalis grown in a glass bottomed 
chamber reveals the formation of complex, multicellular collections of G. 
vaginalis, consistent with biofilm formation (Fig. 8). We will screen the librar
of transposon-insertion mutants generated in Aim 1A for mutants defective in 
biofilm formation. Based on findings in other systems, we predict a role for G. 
vaginalis luxS in this phenotype as well. Our approach is also amenable to 
determination of genes encoding other putative virulence factors of G. 
vaginalis (e.g. adhesins, sialidase and prolidase). 
Aim 1
Define determinants of Gardnerella vaginalis virulence using new genetic techniques. 
Aim 1A: Determine genes required for production and regulation of VLY. 
Experimental Design  Our hypothesis is that the interaction between VLY and hCD59 is crucial to the host 
range and epithelial response to G. vaginalis. By genetically manipulating G. vaginalis we may be able to alter 
epithelial detection and host range, setting the stage for a novel in vivo model of bacterial vaginosis. 
Creation of transposon mutant library   We will generate a library of transposon mutants of G. vaginalis
using the pJAK16-derivative plasmid pVJT128. This construct has been used to mutagenize otherwise 
refractory bacterial species and was created by our collaborator, Dr. David Figurski [65]. G. vaginalis strains 
carrying the plasmid will be selected on HBT agar supplemented with chloramphenicol. Plasmid 
transconjugants will be grown in selective broth, followed by induction of the transposase with IPTG. This 
treatment mobilizes the IS903φkan transposon, which inserts randomly into the G. vaginalis genome. Genome-
wide insertion will be confirmed by Southern blot, as described [65]. Because the cryptic kan gene on the 
transposon is only expressed when inserted into a recipient gene that is being expressed (and not from the 
plasmid itself), the library will be enriched for insertions in coding regions, as described [65]. Candidate 
mutants will be selected on kanamycin and screened for inactivation of the vly gene. As described below, we 
will also prepare vly mutants by targeted disruption. However, the transposon library will provide an unbiased 
screen for regulators of VLY production and other potential virulence determinants. 
Creation of targeted mutations    In addition to generating a VLY-deficient G. vaginalis strain using 
transposon mutagenesis, we will perform targeted disruption of the vly gene by homologous recombination
. A 
targeting construct consisting of the first 500 bp of the vly gene followed by an antibiotic resistance cassette 
(kanamycin resistance), followed by the terminal 500 bp of the vly gene will be cloned into the polylinker of 
pJAK16, which we have demonstrated can be mobilized into G. vaginalis. We will mobilize this plasmid into G. 
vaginalis by conjugation, selecting initially for plasmid-encoded resistance (chloramphenicol), and 
subsequently for resistance encoded by the insert (kanamycin). Kanamycin-resistant, chloramphenicol-
sensitive recombinants should have a disruption of the vly gene and have been cured of plasmid — these 
colonies will be screened for VLY-deficiency as above. We will employ a similar strategy to generate a luxS
deficient mutant
(and complemented strain) to explore its role in VLY regulation as well. 
Phenotypic analysis of mutants    We will screen for transposon insertion
into the vly gene in several ways. 
Qualitatively, we will look for G. vaginalis colonies that are non-hemolytic on human blood agar. The hemolytic 
phenotype of G. vaginalis is human-specific and is likely the result of VLY production. Supernatants from 
overnight growth of individual transformants in 96-well plates will be assayed in at least triplicate for VLY 
production by ELISA and compared statistically (using ANOVA with appropriate post-tests to compare 
individual mutants to the wild-type — this will allow correction for multiple comparisons and will decrease false 
positives). Finally, colonies will be screened by PCR for the vly gene, as transposon insertion should lead to an 
additional ~900 bp of sequence. We anticipate screening ~4,000 colonies, depending on transposition 
efficiency. Similar numbers of colonies were screened in a pVJT128 library of A. actinomycetemcomitans and 
Fig. 8G. vaginalis biofilms. (A
G. vaginalis forms biofilms on 
polystyrene plates as evaluated by 
the safranin assay. (B) Live cell 
imaging of G. vaginalis biofilms in 
glass-bottomed dishes. G. vaginalis 
communities were multicellular and 
spanned >20 µm in height. 
Research Strategy                                                                                             Page 36
Principal Investigator/Program Director (Last, first, middle): Ratner, Adam, Jonathan
How to C#: Preview Document Content Using XDoc.Word
RasterEdge XDoc.Word provide you with APIs to get a thumbnail bitmap of the first page in the word document file. C# DLLs for Word File Preview. Add references:
add page pdf; add pages to pdf file
How to C#: Preview Document Content Using XDoc.PowerPoint
APIs to get a thumbnail bitmap of the first page in the C# DLLs: Preview PowerPoint Document. Add necessary XDoc.PowerPoint DLL libraries into your created C#
add and remove pages from a pdf; add page number to pdf file
generated multiple hits in the catalase gene [65]. If non-hemolytic colonies (or strains that produce either more 
or less VLY than the wild-type are encountered on the ELISA assays) have insertion sites outside the vly locus, 
the insertion site will be determined by inverse PCR
as described [65] using available draft G. vaginalis 
genome sequences. Importantly, this library of insertion mutants will represent a valuable resource for the 
study of G. vaginalis pathogenesis and will be used to screen for other factors linked to virulence. 
Genetic complementation    A VLY-deficient strain of G. vaginalis, cured of plasmid but retaining the 
transposon insertion, will act as a host for introduction of the pJAK16 plasmid carrying either wild-type or 
mutant vly genes. Genetic complementation studies
will establish that phenotypes seen with the VLY-deficient 
strain are truly the result of lack of VLY. Introducing mutant vly sequences will allow dissection of the 
importance of various VLY functions (hCD59 binding, pore-formation) in vivo. Finally, we propose that a VLY-
deficient G. vaginalis expressing the VLY:PLYD4 chimeric toxin, which is species non-selective, would 
represent the first step toward a non-human model for the study of BV (described further in Aims 1B and 2C). 
We hypothesize that the lack of species selectivity of this chimera might allow for colonization of the murine 
genital tract — these studies represent the logical extension of those proposed here and are supported by our 
preliminary data showing enhancement of G. vaginalis colonization of the murine vagina in the setting of PLY 
co-inoculation.  Importantly, we hypothesize that genes other than the vly gene may regulate toxin production
either during growth or in response to environmental conditions. As described above, luxS represents such a 
candidate — one that we believe may be non-essential and may play a role in the density-dependent 
regulation of VLY production. The impact of specific genes (including VLY and regulatory genes such as luxS
will be confirmed via genetic complementation, with correction for any differences in growth rates in mutant 
strains, as assessed by replicate growth curves with monitoring by both OD
and quantitative culture. In the 
complementation and pJAK16 expression studies, it will be important to evaluate the expression levels of VLY 
and other targets (using Western blot and ELISA) in order to ensure that they are at wild-type levels. 
Anticipated Results and Interpretation  We anticipate that by screening several thousand mutants, we can 
identify mutants with insertions in the vly gene. Such mutants should be non-hemolytic on human blood agar, 
should not secrete VLY into their supernatants, and should allow us to probe the role of VLY in G. vaginalis-
epithelial cell interactions more fully. Mutants generated in this series of experiments will also be used in 
studies described above. The ability to compare a VLY-deficient mutant with its complemented derivative will 
be particularly powerful in advancing our understanding of the role of VLY in pathogenesis. 
Potential Pitfalls, Alternative Approaches, and Future Directions      Based on our success in mobilizing 
pJAK16 and pVJT128 into G. vaginalis by conjugation from E. coli, we do not anticipate difficulty in performing 
the experiments with pVJT128. CDC-deficient strains of many Gram-positive species have been generated, 
making it less likely that vly is an essential gene [32,36,66]. Construction of a transposon-mutagenesis library 
of G. vaginalis has uses beyond those detailed in this Aim. There are other putative virulence factors of G. 
vaginalis (prolidase, sialidase, adhesins) that can be investigated in future studies using this tool. Even if we 
are unable to generate a VLY-deficient mutant using transposon mutagenesis, we will still have constructed a 
useful library for the future study of non-essential genes in G. vaginalis.   
Aim 1B: Construct and evaluate specific G. vaginalis strains with altered species specificity. 
Experimental Design   
Expression of chimeric and mutant toxins in trans     The overall goal of this series of experiments is to 
construct and evaluate strains of G. vaginalis that express defined VLY mutant toxins. We will approach this 
goal in two distinct ways. First, we will express wild-type VLY or defined mutants in trans, using plasmid-driven 
expression. Expression will be from the IPTG-driven Ptac promoter in pJAK16 or from the cloned vly promoter 
region. These strains will be generated in the background of vly-deficient mutants of G. vaginalis generated in 
Aim 1A and will overlap to some extent with the genetic complementation studies described above. However, it 
is important that these experiments not depend entirely on our success in Aim 1A, so we can also perform 
these manipulations in a wild-type G. vaginalis background. The disadvantage of the latter approach is that 
there would be expression of VLY from the chromosomal locus. The advantage is that useful in vitro and in 
vivo data (especially with the VLY:PLYD4 chimera) may still be obtained. 
Generation of unmarked chromosomal mutations at the vly locus     The use of insertion mutants in the 
vly locus is not ideal, as such constructs may have polar effects. The complementation studies will address 
Research Strategy                                                                                             Page 37
Principal Investigator/Program Director (Last, first, middle): Ratner, Adam, Jonathan
C# PDF insert image Library: insert images into PDF in C#.net, ASP
How to insert and add image, picture, digital photo, scanned signature or logo into PDF document page in C#.NET class application?
add pages to pdf; add page pdf reader
VB.NET PDF File Compress Library: Compress reduce PDF size in vb.
Remove bookmarks, annotations, watermark, page labels and article threads from PDF while compressing. Also a preview component enables compressing and
add pages to pdf acrobat; adding page numbers to pdf files
that possibility, but such effects may still be important. For that reason, we will engineer targeted, unmarked, 
in-frame mutations of the vly locus
. Several such strains will be generated, including an unmarked, in-frame 
deletion of the vly coding region, a replacement of the vly coding region with one coding for the VLY:PLYD4 
chimeric toxin, and one coding for the VLY-P480W mutant that binds hCD59 but does not form pores due to a 
mutation in the undecapeptide. As a control, we will make a strain in which the wild-type vly coding region is 
reintroduced in order to control for potential changes induced through targeting. To generate these strains, we 
will employ a combined positive- and negative-selection strategy
. We have successfully used such methods in 
the gram-positive pathogen Streptococcus pneumoniae to generate wild-type, deletion, and toxoid-expressing 
mutants at the pneumolysin locus [67]. We will use the bicistronic "Janus cassette" first described by Sung et 
al. [68], based on its successful application in related gram-positive organisms. This strategy of selection and 
counterselection yields first a G. vaginalis strain in which the vly locus has been replaced by the Janus 
cassette (conferring Km-resistance and dominant Sm-sensitivity). In subsequent steps, defined mutants 
(mutant vly genes or an in-frame deletion of the coding sequence) are constructed, as loss of the Janus 
cassette can be selected for by reversion to Sm resistance. We have generated multiple Sm-resistant G. 
vaginalis strains without difficulty. Once the targeted strains have been constructed, we will confirm the 
structure of the modified locus using PCR and sequencing. As the native promoter will be retained, we do not 
anticipate changes in expression of mutant VLY. The Janus cassette insertion and the in-frame deletion should 
be devoid of VLY expression. 
Phenotypic analysis    Strains will be compared for vly transcription and VLY production by RT-PCR and 
ELISA respectfully. Supernatants will be tested for hemolytic activity against human, sheep, and horse blood to 
compare species selectivity index (HD
(sheep or horse)) calculated and compared by ANOVA 
with post-tests. Stimulatory activity on vaginal epithelial cells will be assessed (examining pp38 
phosphorylation, c-fos upregulation, IL-1β maturation, and IL-8 induction). Western blot, real-time RT-PCR, 
and ELISA techniques will be used with quantification (densitometry for westerns) and statistical comparisons 
appropriate for each.  
Anticipated Results and Interpretation     These defined mutants will allow for detailed dissection of the 
importance of VLY to species selectivity and various epithelial inflammatory responses. Specifically, we 
anticipate that strains expressing the non-selective VLY:PLYD4 chimera will induce cytolysis and signaling in 
non-human cells. VLY-deficient strains should lack or have severely attenuated lytic and inflammatory 
consequences. We hypothesize that pore formation by VLY will be crucial to some responses (p38 MAPK 
phosphorylation), but that hCD59 ligation will be required for others (such as FRNK phosphorylation, which 
requires signaling through src family kinases downstream of hCD59). The CDCs may act as ligands for TLR4 
independent of pore-formation [69,70]. These engineered strains will permit elucidation of pathways that are 
independent of both pore-formation and hCD59 binding.  
Potential Pitfalls, Alternative Approaches, and Future Directions     Alternative Gram-positive 
counterselection strategies include the upp gene used in Enterococcus faecalis [71] and sucrose 
counterselection, successfully used in Bacillus and other species [72]. At the conclusion of this Aim, we will 
have constructed new strains of G. vaginalis with defined alterations at the vly locus, including insertion 
mutants, in-frame deletion, replacement with mutant toxin sequences, and the important control, reinsertion of 
the wild-type vly sequence. We have already shown that VLY is sufficient
to induce lytic and inflammatory 
responses in vitro. However, the use of these targeted mutants will allow us to confirm that VLY is necessary
In addition, the use of non-E. coli derived materials will minimize possible effects of LPS. In addition, we will 
have generated extremely useful strains for in vivo studies (Aim 2)Those studies can proceed without these 
engineered strains, but the ability to assess the relative contribution of various aspects of the VLY:hCD59 
interaction in vivo will be very valuable.  
Aim 1C: Determine genes required for biofilm formation in G. vaginalis
Experimental Design       While we hypothesize that VLY production is crucial for G. vaginalis colonization, it 
is clear that there are other factors that may contribute to virulence. Among these is the ability to form biofilm, 
which appears to be very important in BV pathogenesis and clinical treatment failures [63,64,73]. 
Phenotypic screen for biofilm-deficient mutants    We will use the mutant library generated in Aim 1A to 
determine genes required for biofilm production. As a positive control, the targeted luxS mutants represent a 
Research Strategy                                                                                             Page 38
Principal Investigator/Program Director (Last, first, middle): Ratner, Adam, Jonathan
VB.NET PDF insert image library: insert images into PDF in vb.net
inserting image to PDF in preview without adobe provide users the most individualized PDF page image inserting function, allowing developers to add and insert
adding a page to a pdf document; add a blank page to a pdf
How to C#: Preview Document Content Using XDoc.excel
you with APIs to get a thumbnail bitmap of the first page in the C# DLLs: Preview Excel Document without Microsoft Office Installed. Add necessary references:
add a page to a pdf; adding page numbers to pdf document
candidate gene that we hypothesize will have a substantial effect on biofilm formation. Individual transposon 
insertion mutants will be grown in at least triplicate in 96-well polystyrene plates as described above and 
compared to the parental strain. At 24 and 48 hr (duplicate plates, triplicate wells), liquid will be removed for 
colony counts in order to ensure that mutants with overall growth phenotypes are not mischaracterized as 
biofilm mutants. Wells will be washed and adherent organisms stained with safranin. After removal of excess 
dye and washing with water, adherent safranin will be solubilized and OD
measured. Mutants will be 
compared to wild-type by ANOVA with Tukey post-test, and strains with significant differences will have the 
transposon insertion site determined by inverse PCR as in Aim 1A. While growth on polystyrene may be useful 
as an initial screen, it is not an ideal model of biofilm formation in vivo. We will also examine all putative 
mutants (as well as the wild-type and a subset of strains without a phenotype on the safranin assay) in 
additional measures of biofilm formation. These will include growth on glass-bottomed dishes with live-cell 
imaging and quantitative analysis of community structure (mean height and diameter of organism groups per 
field — at least 5 fields per strain, compared statistically) as well as growth in the presence of human epithelial 
cells. Mutants will also be assessed for VLY production by ELISA and compared statistically.  
Targeted mutation and complementation     Candidate G. vaginalis mutants deficient in biofilm formation will 
be genetically complemented as described above for vly-deficient strains, and the specificity of the phenotype 
determined using assays of biofilm formation. It may be advantageous to construct unmarked, in-frame 
deletions using the Janus cassette in order to minimize polar effects. The mutants identified in these 
experiments will be tested in vivo using the hCD59-transgenic mouse (Aim 2) to determine the effect of biofilm 
phenotypes in colonization and pathogenesis.
Anticipated Results and Interpretation      Based on our preliminary data and on the presence of putative 
homologues of known quorum-sensing genes in the draft G. vaginalis genomes, we hypothesize that there will 
be non-essential genes regulating biofilm production and that these will be identified using our transposon 
mutagenesis approach. Because of the importance of biofilms to G. vaginalis pathogenesis and antibiotic 
resistance [64,73], we hypothesize that such pathways will be of substantial utility in murine models.  As 
above, it is important to also test a priori hypotheses of involved pathways. Thus, we will use targeted mutant 
strains deficient in the production of luxS, the gene for AI-2 synthesis, as initial candidates
Potential Pitfalls, Alternative Approaches, and Future Directions     Redundant or essential genes may not 
be identified using this approach. However, based on findings in other Gram-positive organisms, we anticipate 
that we will find mutants with altered phenotypes in this screen and that these will be useful both in further in 
vitro studies (e.g. of antimicrobial susceptibility) and in murine models. These same techniques are applicable 
to identification of other putative virulence factors of G. vaginalis such as sialidase, prolidase, and adhesins, 
each of which would be useful to test in vitro and in vivo. 
Aim 2
Determine the role of VLY in G. vaginalis at the host-pathogen interface in vitro and in vivo. 
Aim 2A: Determine the role of VLY-induced membrane blebbing as a mechanism for protection of 
vaginal epithelial cells from toxin pores and as a pathway sensitizing cells to complement. 
Experimental Design     In addition to activating immune pathways, mucosal epithelial cells can undergo 
ultrastructural rearrangements in response to microbial products. Examples of this include actin pedestal 
formation in intestinal epithelial cells in response to pathogenic E. coli [74] and epithelial extrusion in response 
to L. monocytogenes [75]. Although actin rearrangement in response to toxins has been described [76], we 
have characterized a novel epithelial response to a pore-forming toxin — the rapid formation of blebs in 
response to VLY. This response does not occur with other toxins that we have tested and is recapitulated by 
either antibody against hCD59 or the GFP:VLYD4 fusion. We propose that this response requires hCD59 
signaling following VLY binding, representing a novel pathway for mucosal recognition of toxins. 
Live cell imaging of hCD59-dependent bleb formation    In this Aim, we will use cultured epithelial cells in 
order to understand the response of physiologically relevant cell types to G. vaginalis and VLY. We will use 
both HeLa cells and VK2/E6E7, which is a vaginal epithelial cell line transformed by human papilloma virus 
proteins [77]. We will take advantage of the recent commercial availability of a three-dimensional human 
primary vaginal epithelial model (EpiVaginal; MatTek). This model preserves native architecture and polarity 
due to culture at an air-liquid interface. In addition, we have extensive experience with primary cell culture, 
including the growth and characterization of primary ciliated murine epithelial cells [78]. Thus, we will grow and 
Research Strategy                                                                                             Page 39
Principal Investigator/Program Director (Last, first, middle): Ratner, Adam, Jonathan
C# PDF insert text Library: insert text into PDF content in C#.net
Able to add a single text character and text string formatted text and plain text to PDF page using .NET Supports adding text to PDF in preview without adobe
add pages to pdf in preview; adding page numbers in pdf file
validate primary murine vaginal epithelial cells as described [79,80]. These cells will be derived from hCD59 
transgenic mice or their transgene-negative littermates.  
Epithelial cells will be treated with VLY at sublytic concentrations, as we have demonstrated that significant 
blebbing occurs at concentrations well below those required for cytolysis. A range of concentrations will be 
used and will be based on preliminary experiments for each cell line. Cell death will be assessed in at least two 
ways. First, duplicate wells for each condition will be inspected visually for monolayer integrity and then 
assessed by trypan blue exclusion for estimation of cell death. Second, supernatants will be assayed for 
lactate dehydrogenase (LDH) release and compared to control wells and to 100% lysis (treatment of cells with 
1% Triton X-100) for quantification of cell death. In order to exclude the potential confounding effects of LPS 
contamination of recombinant protein preparations, we will use proteins that have been run over polymixin 
columns (buffers for vehicle controls will be treated identically) and will confirm that purified E. coli LPS does 
not induce blebbing. We will also use heat-inactivated preparations in order to further assess the contribution 
of heat-stable contaminants such as LPS. Lactococcus expression systems would represent another strategy 
to reduce the potential effects of LPS. We will follow the dynamics of epithelial bleb formation in real-time using 
fluorescence microscopy (Fig. 6). Epithelial cells will be stimulated with G. vaginalis (wild-type, mutant, and 
complemented strains), purified VLY (both wild-type and hCD59 binding-deficient mutants), purified 
complement components, and antibody to hCD59 at various concentrations. Prior to stimulation, the cells will 
have been labeled with two fluorescent dyes as above. Bleb formation will be monitored over at least a 4 hr 
period. Parameters to be assessed in at least 10 fields per condition and compared statistically will include 
percentage of cells with visible blebs per high-power field, mean bleb diameter (ImageJ; NIH), and number of 
blebs per cell. We anticipate that each of the ligands that bind and crosslink hCD59 will lead to bleb formation 
that can be monitored in real-time. In order to determine the specificity of this effect for hCD59, we will 
compare CHO-hCD59 with control CHO-IRES cells as well as control vs. hCD59-transgenic murine cells and 
evaluate the rapid bleb response. We will also transfect vaginal cells with siRNA targeting hCD59 (and 
scrambled controls), assess efficiency and knockdown, and compare bleb formation among transfected cells. 
hCD59 loss and complement sensitivity    We hypothesize that bleb formation will lead not only to removal 
of toxin monomers from vaginal epithelial cells but also to loss of hCD59 from the cell surface
. This could 
potentially serve both a protective function (cells with less hCD59 may be less sensitive to the VLY that 
remains in solution) and dangerous one (cells lacking hCD59 may be more sensitive to complement-mediated 
lysis.) Antibody methods can detect surface hCD59 (Fig. 6B). We will induce blebbing as above and allow the 
cells to recover for various periods. Cells will be fixed and surface hCD59 availability assessed by flow 
cytometry using anti-hCD59 monoclonal antibodies. Many hCD59 antibodies have been used for flow 
cytometry, including some that bind at sites distinct from the complement/VLY binding site, and several will be 
used in independent experiments to distinguish lack of reactivity due to an occupied binding site from absence 
from the cell surface. In order to assess the physiologic relevance of loss of hCD59, we will carry out VLY-
sensitivity and complement lysis assays
. Following blebbing, cells will be washed and allowed to recover for 
various periods (1-24 hr). At regular intervals, cells will be exposed to various doses of either VLY or 
delipidated human serum (with complement components but without cholesterol due to inhibitory effects on 
toxin activity). Cytolysis will be measured and evaluated statistically by LDH assay as above. 
Anticipated Results and Interpretation       Signaling through hCD59 may represent a novel pathway of toxin 
recognition and a link between VLY binding and rapid bleb formation. We hypothesize that hCD59-binding 
toxin preparations and whole G. vaginalis will initiate epithelial bleb formation and that VLY-deficient bacteria or 
hCD59-independent toxin mutants will not. In addition, we propose that shedding of VLY-hCD59-containing 
blebs may render cells less sensitive to immediate re-exposure to VLY (due to loss of receptor) but more 
sensitive to autologous complement (due to the loss of an inhibitor of membrane attack complex deposition). 
Either of these findings would represent a new understanding of toxin-induced epithelial response with 
implications beyond VLY and G. vaginalis
Potential Pitfalls, Alternative Approaches, and Future Directions      A variety of cellular mechanisms to 
respond to microbial toxins have been described, but none involving hCD59. Because of the importance of 
hCD59 in complement restriction and its ubiquitous expression, such a pathway may be of considerable 
relevance. One immediate future direction will be determination of specific hCD59 signals linking receptor
ligation to bleb formation
. hCD59 signaling involves initiation of calcium fluxes and activation of src-family 
Research Strategy                                                                                             Page 40
Principal Investigator/Program Director (Last, first, middle): Ratner, Adam, Jonathan
tyrosine kinases. We can determine the role of calcium fluxes by preloading cells with BAPTA/AM, a cell-
permeant calcium chelator and by live-cell calcium imaging using Fluo-4/AM. We have successfully used both 
of these techniques in similar settings [81]. We will use both pharmacologic and siRNA-mediated approaches 
with appropriate controls to inhibit specific members of the Src kinase family (primarily Src and Lck, for which 
specific inhibitors are available). These studies will assist us in further delineating the signaling pathways 
linking hCD59 binding to bleb formation. One potential pitfall is potential redundancy within signaling pathways 
such as the src kinase family. As a result of this, partial effects (such as decreased bleb size or number) may 
be observed. This is the reason for the quantitative and statistical approach to bleb assessment and for the use 
of general as well as specific inhibition strategies. hCD59 is a GPI-anchored protein and, as such, lacks 
transmembrane and cytoplasmic domains. Thus, in order to initiate intracellular signaling, hCD59 must 
complex with other proteins, analogous to LPS sensing mediated by GPI-anchored CD14, which complexes 
with Toll-like receptors [53]. If the pathway responsible for linking hCD59 to bleb formation remains unclear, we 
will perform immunoprecipitation of hCD59 and attempt to identify novel binding partners of hCD59. 
Aim 2B: Define the role of the VLY-hCD59 interaction in G. vaginalis pathogenesis in vivo. 
Experimental Design  We have generated hCD59 transgenic mice, as described in Preliminary Studies 
above. Having confirmed appropriate expression and cell-surface localization of hCD59, we will perform 
murine vaginal colonization with G. vaginalis
. This protocol has been approved by the Columbia University 
IACUC (Protocol AC-AAAB0279, Development of a murine model of bacterial vaginosis). In order to determine 
the necessity for hCD59 transgene expression, transgenic animals will be compared with their transgene-
negative littermates in each of the experiments described.  
Murine vaginal colonization     Adult female estrus-synchronized mice (7 animals per group  see power 
calculation in Vertebrate Animal section) will be anesthetized, and PBS-washed, log-phase Sm-resistant G. 
vaginalis will be instilled into the vagina in 10 µl total volume. Total organism burden to be initially evaluated 
will range from 10
cfu/10 µl PBS. Control animals will receive 10 µl of sterile PBS in identical fashion. G. 
vaginalis strains to be evaluated will include laboratory strains and clinical isolates. Vaginal samples will be 
collected every 24 hr for 7 days in initial experiments. Sampling will consist of collection of a 100 µl vaginal 
lavage to be processed for quantitative culture on selective media, ELISA (for VLY as well as selected murine 
cytokines including IL-1β), and pH. ELISA values will be normalized to total protein to account for differences in 
collection efficiency. In addition, a swab will be collected using the standardized methodology described above, 
and Gram-stained smears will be scored for the presence of clue cells. These gram stained slides will also be 
evaluated by two blinded reviewers who have been trained in the Nugent scoring system for BV [1]. Scores will 
be tabulated, interrater reliability assessed (κ statistic), and disagreement >2 points on the Nugent scale 
adjudicated by a third blinded reviewer. At each time point, groups will be compared for G. vaginalis load, local 
VLY concentration, local cytokine levels, pH, and Nugent score using appropriate non-parametric statistics 
(Kruskal-Wallis) and post-tests. It is important to note that the lavage specimens will be limited in volume, and 
it may not be possible to perform all testing proposed during the initial experiments. In that case, we will 
prioritize quantitative culture, pH, VLY ELISA, and Nugent scoring (which does not require liquid sample). In 
order to confirm that the wash procedure does not alter the duration of colonization, selected groups of animals 
will be sampled only at later time points. At the conclusion of the experiment, animals will be euthanized and 
blood collected for analysis of IL-1β and IL-8 levels, antibody titers to VLY, and histopathology. 
Determination of the role of VLY and biofilm in colonization     Once we have established optimal 
conditions for murine colonization, we will confirm the requirement for VLY in G. vaginalis colonization by 
comparing VLY-deficient and complemented strains for efficiency of colonization in this model. The VLY toxoid-
expressing strain and its control will be useful to determine the role of pore formation by VLY. Strains will also 
be compared at the level of induction of inflammation and pathology (Nugent score, pH changes). The 
requirement for biofilm formation in vivo in G. vaginalis colonization and induction of disease can be assessed 
using mutants (and complemented derivatives) identified in Aim 1C (as well as the luxS-deficient strain, though 
that may have both VLY and biofilm defects). As rigorous proof that the VLY species specificity dictates host 
range and pathology, we will test strains of G. vaginalis expressing the hCD59-independent toxin chimera, 
VLY:PLYD4. These strains should colonize and induce pathology in wild-type mice and hCD59 transgenics. 
Anticipated Results and Interpretation    We hypothesize that VLY is a major determinant of host range and 
pathogenesis. Thus, both of these approaches (wild-type G. vaginalis in the hCD59-transgenic mouse and 
Research Strategy                                                                                             Page 41
Principal Investigator/Program Director (Last, first, middle): Ratner, Adam, Jonathan
VLY:PLYD4-expressing G. vaginalis in the wild-type mouse) should produce colonization, immune responses, 
and pathology. We will gain information about the relative importance of pore-formation and hCD59 signaling 
and will have developed an extremely valuable small animal model of BV. 
Potential Pitfalls, Alternative Approaches, and Future Directions    If it is difficult to colonize either wild-
type or hCD59-transgenic mice under these conditions, we will undertake two alternative strategies. First, we 
will use mouse-passaged strains of G. vaginalis. The advantage of this procedure is that it would enrich the 
sample for more adherent, possibly more robust, colonizers. The disadvantage is that the differences between 
the passaged strains and the original wild-type would be unknown and might require substantial effort to 
characterize. The second approach would be to use intravaginal instillation of purified VLY (in the case of 
hCD59-transgenics) or PLY or VLY:PLYD4 (in the case of non-transgenic mice) in various concentrations. We 
have used this strategy to enhance G. vaginalis colonization in the past. In addition, depending on the specific 
results obtained in these experiments, we should be able to progress to understanding specific components of 
immunity required for control of G. vaginalis colonization and disease
. We can cross the hCD59 transgene into 
murine lines deficient in various components of innate or adaptive immunity in order to determine the specific 
requirements for each of these in colonization or pathogenesis. Alternatively, the VLY:PLYD4-expressing 
organisms could be used in those hosts directly.  
Aim 2C: Evaluate candidate inhibitors of the VLY-hCD59 interaction in vivo. 
Experimental Design     We will use the techniques described in Aim 2B for in vivo modeling of G. vaginalis 
colonization and bacterial vaginosis. Importantly, though this Aim builds on the results of the prior experiments, 
it is not dependent on the establishment of a long-term colonization model with G. vaginalis.  
Antibody and toxoid-based inhibition studies     We will use our existing polyclonal anti-VLY antibodies, 
which block cytolysis and epithelial toxin detection in vitro, to prevent VLY-mediated pathology in vivo. In 
addition, we will use dominant-negative toxoid VLY, which interferes with VLY-mediated pore formation. Using 
the colonization model developed in Aim 2B (or purified toxin delivery if the colonization model is 
unsuccessful), we will deliver candidate inhibitors in various concentrations prior to (and, in subsequent 
experiments, concurrently with or following) colonization with G. vaginalis. For wild-type G. vaginalis, we will 
use the hCD59-transgenic mouse. For VLY:PLYD4-expressing G. vaginalis, the experiments will take place in 
wild-type mice. Outcomes will be evaluated as in Aim 2B, with G. vaginalis quantitative culture, local cytokine 
production, and altered pH. IC
values will be compared, and non-parametric statistical analysis among 
groups will account for multiple comparisons. 
Anticipated Results and Interpretation      We anticipate that local delivery of either antibody targeting VLY 
or dominant-negative toxoid will be effective in inhibiting the G. vaginalis- or VLY-mediated pathology in our in 
vivo models. In addition, we hypothesize that if VLY is itself necessary for colonization that colony counts and 
colonization duration will be shortened as well. Either of these findings would represent a major advance, as 
the current therapeutic options for BV are limited and are associated with frequent treatment failures. 
Potential Pitfalls, Alternative Approaches, and Future Directions      While we hypothesize that VLY is 
essential for G. vaginalis to cause disease, candidate inhibitors may be ineffective in vivo despite disrupting 
toxin function in vitro. Mucosal delivery of biomolecules can be difficult, and it is possible that not enough 
toxoid or antibody will be retained to be effective. There are various physical methods that we could use to try 
to address that situation, including the use of gels already formulated for use in vaginal microbicides. Future 
directions will include screening for small molecule inhibitors of VLY using cytolysis assays in vitro (with 
subsequent testing of lead compounds in vivo) and generation of monoclonal antibodies against VLY. It is 
crucial to ensure that these inhibitors do not inhibit hCD59 binding to C8/C9, as this could sensitize host cells 
to complement attack. Further mutant studies to determine the precise binding site for VLY on hCD59 (and 
whether it is identical to the C8/C9 site) would be important for such investigations.  
At the conclusion of these Aims, we will have gained new information regarding the role of VLY in G. vaginalis 
pathogenesis and will have generated new in vivo models and candidate therapeutics. Our long-term goal, 
understanding and preventing the adverse sequelae of BV, will be greatly aided by the program of research 
described here, and we thank you for your consideration. 
Research Strategy                                                                                             Page 42
Principal Investigator/Program Director (Last, first, middle): Ratner, Adam, Jonathan
Description of the Proposed Use of Animals 
A major goal of this research is to develop and characterize murine models of bacterial 
vaginosis. Based on our prior work involving murine infection models and a power 
analysis, we have calculated that 7 mice per group will be required to detect differences 
of 0.5 log
cfu/ml, assuming 80% power, a desired P value of 0.05, a standard deviation 
of 0.25 log
cfu/ml, and a failure rate of 10%. These calculations are based on 
quantitative culture to be performed at the conclusion of the experimental time course. 
Specific groups to be tested are delineated above and include control (PBS-treated) 
mice and mice receiving intravaginal G. vaginalis at various concentrations. Experiments 
will be performed in hCD59-transgenic and non-transgenic animals and will use strains 
of G. vaginalis described above. 
Justification of Animal Use, Species Selected, and Numbers 
Bacterial vaginosis is an important cause of preterm birth and a risk factor for sexually 
transmitted diseases in humans. To date, there have been no animal models of this 
disease. For this reason, it is crucial to understand whether the species selectivity of the 
major G. vaginalis toxin, vaginolysin (VLY), is involved in this limited host range. In vitro 
models have proven inadequate for studying the complex ecosystem of the vaginal 
mucosa, particularly with regard to microbial infection. Currently available models are 
limited with respect to their ability to evaluate spatial and temporal changes in bacterial 
and host cell distributions. We plan to use C57BL/6 mice and matched transgenics 
expressing the hCD59 receptor to determine the role for VLY in this setting. 
Animals are not involved in the experiments in Aim 1 or Aim 2A. In Aim 2B, we calculate 
a need for 19 groups of 7 mice each for studies involving hCD59-transgenic animals (3 
concentrations for each of 6 G. vaginalis strains, 1 PBS control group) as well as 7 
groups of 7 mice each for studies involving wild-type mice and chimera-expressing G. 
vaginalis (3 concentrations for each of 2 G. vaginalis strains, 1 PBS control group). In 
Aim 2C, the precise numbers will depend to some extent on our findings in Aim 2B. At a 
minimum, this would include 13 groups of 7 mice each (3 concentrations of 2 inhibitors, 
G. vaginalis strains, 1 PBS control group). This leads to an estimated need for 39 
(19+7+13=39) groups of 7 mice, for a total of 273 mice over the study period. 
Veterinary Care 
Mice will be housed in the barrier ABSL2 facility at Columbia University College of 
Physicians & Surgeons. This facility is attended by a full-time veterinary and support 
staff that is experienced in providing high quality care to laboratory animals. C57BL/6 
mice and transgenic models are in wide use at Columbia, and the veterinary staff is 
experienced and equipped to house and care for them. All animals will be in a specific 
pathogen-free setting, receive food and water ad libitum, and otherwise receive standard 
Procedures for Limitation of Pain, Discomfort, and Injury 
Intravaginal inoculation and lavage/culture are performed in anesthetized 
(ketamine/xylazine) mice in order to limit discomfort. This is not a dangerous procedure, 
and sampling takes less than 1 minute per animal. Mice are immediately returned to 
their cages and generally do not have ill effects. Animals are monitored daily, and mice 
that become ill during these experiments will be euthanized. Blood drawing and 
obtaining material for histopathologic analysis will only be done at the conclusion of the 
time course, following euthanasia. 
Vertebrate Animals                                                                                            Page 43
Principal Investigator/Program Director (Last, first, middle): Ratner, Adam, Jonathan
Documents you may be interested
Documents you may be interested