Spectral Separation
181    PerkinElmer          
4. Select Create New from the Actions menu.
5. Select Spectral Signature...
The Create Spectral Signature dialog opens.
Volocity will assign a sample color and perceived peak wavelength to your new spectral signature. 
6. Give the spectral signature a meaningful name and click OK to create the signature.
Spectral signatures are added to your library.
Pdf reverse page order online - re-order PDF pages in C#.net, ASP.NET, MVC, Ajax, WinForms, WPF
Support Customizing Page Order of PDF Document in C# Project
reorder pages pdf file; reorder pages in pdf preview
Pdf reverse page order online - VB.NET PDF Page Move Library: re-order PDF pages in vb.net, ASP.NET, MVC, Ajax, WinForms, WPF
Sort PDF Document Pages Using VB.NET Demo Code
change pdf page order preview; how to move pages around in pdf file
Volocity Acquisition Installation and Reference
September 2011  182
7. Inspect a spectral signature by double clicking on its library item.
You should make a spectral signature for each of the fluorophores that you wish to include in your 
experiments. You can un-mix up to three fluorophores in each experiment.
Creating Spectral Signatures from Monochrome Images
Successful spectral separation is dependent on the creation of accurate spectral signatures. A 
spectral signature allows Volocity to calculate how a single fluorophore contributes to each point of a 
lambda stack.   
To generate a spectral signature:
1. Prepare a sample that contains only a single fluorophore. 
2. Acquire a lambda stack of the specimen into an image sequence. 
3. Open your image or image sequence in the Image View and select a region brightly stained with 
your fluorophore with a region of interest tool, such as the magic wand tool. You should ensure 
that no pixels in this region are saturated.
4. Select Create New from the Actions menu.
5. Select Spectral Signature...
C# Word: How to Use C# Code to Print Word Document for .NET
document pages in original or reverse order within entire C# Class Code to Print Certain Page(s) of powerful & profession imaging controls, PDF document, image
rearrange pages in pdf file; move pages within pdf
Spectral Separation
183    PerkinElmer          
The Create Spectral Signature dialog opens.
6. Enter a name for your spectral signature and click OK.
Spectral signatures are added to your library. 
7. Inspect a spectral signature by double clicking on the library item.
8. Make a spectral signature for each of the fluorophores that you wish to include in your 
experiments.
Separating Color Images
In order to accurately separate each of the channels from your color image, Volocity will need to 
calculate the contribution made by background. This can be done automatically or you can select a 
region of interest that contains only background. Volocity can calculate the background directly from 
this region of interest or you can create a background spectral signature, which you may re-use if your 
background is consistent between multiple image sequences. To make a background spectral 
signature:
1. With your region of interest selected, select Create New then Spectral Signature... from the 
Actions menu. 
2. Give the background spectral signature a name and click OK.
3. Select an image or image sequence of a multiply (two or three fluorophores) labeled color 
specimen. 
4. Select Separate Spectra... from the Tools menu.
Volocity Acquisition Installation and Reference
September 2011  184
5. In the Separate Spectra dialog select the spectral signatures of the fluorophores in your color 
image from the drop-down menus. Each of the spectral signatures in your library will be listed in 
the drop-down menus.
6. Select one of the Calculate background from radio buttons.
7. Calculate the background, select the Default background radio button if you want Volocity to 
automatically.
8. If you have made a background spectral signature, select the This spectrum radio button and 
select your spectral signature from the drop-down menu.
9. If you have specified a region of interest containing only background, choose the Current 
Selection radio button. If your image sequence is time resolved, the background will be 
calculated from the first timepoint only unless you select the Recalculate for each timepoint 
checkbox.
When you select Recalculate for each timepoint the background is recalculated for every timepoint 
from the same region of interest. You must be certain that your region of interest always contains only 
background (and that no objects of interest stray into your region during the course of the time series).
10. Click Separate.
New channels based on your selected spectral signatures will be added to your image sequence. The 
new channels are monochrome and are colored based on the color of the spectral signature from 
which they were derived.
Spectral Separation
185    PerkinElmer          
If you un-mix a color image, new monochrome images will be added to a folder of images beneath 
your original image.
Separating Monochrome Images (Lambda Stacks)
Acquire lambda stacks of specimens labelled with the combination of fluorophores that you wish to 
separate. You must acquire your experimental specimens at exactly the same wavelengths and 
relative exposures as your spectral signatures.
In order to accurately separate each fluorophore into its own channel from your lambda stacks, 
Volocity will need to calculate the contribution made by background. This can be done automatically 
or you can select a region of interest that contains only background. Volocity can calculate the 
background directly from this region of interest or you can create a background spectral signature, 
which you may re-use if your background is consistent between image sequences. To make a 
background spectral signature:
1. With your region of interest selected, select Create New then Spectral Signature... from the 
Actions menu. 
2. Give the background spectral signature a name and select OK.
3. Open an image sequence in the image view.
4. Select Separate Spectra... from the Tools menu.
In the Separate Spectra dialog select the spectral signatures from the drop-down menus of the 
fluorophores that you wish to un-mix from your lambda stacks. 
The number of drop-down menus will be equal to the number of images in your lambda stacks. 
Each menu contains a list of all the spectral signatures in your library that were derived from lambda 
stacks containing the same number of images as the image sequence that you wish to un-mix.
If you have over-sampled (i.e. the number of images in each lambda stack is greater than the number 
of fluorophores in your experiment) then you may leave some of the drop-down menus as the default 
(No spectrum). 
5. Select one of the Calculate background from radio buttons.
Volocity Acquisition Installation and Reference
September 2011  186
6. Select the Default background radio button, if you want Volocity to automatically calculate the 
background.
7. If you have made a background spectral signature select the This spectrum radio button and 
select your spectral signature from the drop-down menu.
8. If you have a region of interest containing only background selected (in the image view) choose 
the Current Selection radio button. If your image sequence is time resolved the background will 
be calculated from the first timepoint only unless you select the Recalculate for each timepoint 
checkbox.
When you select the Recalculate for each timepoint, the background will be recalculated for every 
timepoint from the same region of interest. You must be certain that your region of interest always 
contains only background (and that no objects of interest stray into your region during the course of 
the time series).
9. Click Separate.
New channels, based on your selected spectral signatures, will be added to your image 
sequence. The new channels will contain only information from a single fluorophore.  
Live Fast Restoration
187    PerkinElmer          
Live Fast Restoration
Volocity Acquisition supports Fast Restoration deconvolution. This option is available in the Video 
Preview window if you have purchased the Volocity Restoration extension product. 
Fast Restoration should only be used with single plane acquisition protocols. If you have multiple 
planes, you should capture them first and deconvolve them later using Volocity Restoration.
Important: You must create or import a PSF for each channel that will be captured before you can set 
up the acquisition. 
1. Make sure that Fast Restoration is selected in the Devices Preferences window. 
2. You can configure the settings from the Options... button or by double clicking on the Fast 
Restoration icon on the Video Preview window.
3. Ensure that you have the correct PSFs for the channels that you wish to acquire in your Volocity 
library.
4. Double click on the Fast Restoration icon. 
The Fast Restoration dialog opens.
Volocity Acquisition Installation and Reference
September 2011  188
5. Select a PSF for each channel that will be captured from the drop-down menus.
6. Decide on the number of neighboring slices that will be included in the restoration algorithm and 
enter the value in Capture this many slices above and below field. The more neighboring slices 
you include, the longer the process will take.
7. Select the appropriate focus drive from the Change focus using drop-down menu.  
8. Enter an appropriate value for Use this Z spacing.
9. Select the appropriate option for Generate result using.
ɸ
Center Image displays only the deconvolved center image.  
ɸ
Extended focus creates a single image by making a brightest-point merge of all the 
deconvolved Z-slices of a volume.
10. Click OK. 
11. Check the Fast Restoration box on the Video Preview window. The first time you do this after 
configuring the settings can take some time as Volocity applies the algorithm and generates the 
deconvolved image.
OptiGrid
®
The OptiGrid
®
is an optical sectioning technology that, when combined with image analysis software, 
confers confocal capabilities to wide field microscopes.
The OptiGrid
®
consists of two pieces of additional hardware:
ɸ
The OptiGrid
®
paddle, which is inserted into the microscope’s fieldstop location and is 
connected to
ɸ
The OptiGrid
®
controller box
The OptiGrid
®
is based on a technique called “Structured Light” (Neil et al 97).  
This technique modifies the illumination system of a microscope to project a grid pattern onto the 
specimen. The grid is moved into three different positions, and an image is acquired at each position. 
An algorithm is then used to produce a single, derivative, confocal image from which the grid pattern 
has been removed. 
Connecting the OptiGrid®
189    PerkinElmer          
The algorithm takes advantage of the fact that in-focus information changes as the grid moves, whilst 
out-of-focus information remains constant. Therefore, if information does not change between images, 
it is out of focus and can be removed from the final image.
Please see the appendix for more information about the algorithm and related publications.
OptiGrid
®
Models
With some models of microscope, chromatic aberration problems have made it difficult or impossible 
to place the grid pattern in common focus for all excitation wavelengths in use. With earlier OptiGrid
®
models, this restricted the range of excitation wavelengths that could be used together to acquire 
image sequences, and created a need for manual refocusing of the OptiGrid
®
 
The second-generation OptiGrid
®
, sometimes referred to as the ‘Focusing OptiGrid
®
’, incorporates a 
motor that enables it to be moved axially into different focal positions in the light path of the 
microscope. Once the correct focal position for an excitation wavelength is established it can be 
consistently and automatically restored. This extends the range of excitation wavelengths that can be 
sequentially acquired into a single image sequence.
All OptiGrid
®
models are supported in versions 4.1 or higher for Mac OS X and Windows. 
You need a spare USB port in order to run an OptiGrid
®
.
Note: Manual focus models of the OptiGrid
®
are connected via the Improvision Acquisition Hub. 
Connecting the OptiGrid
®
This section describes how to connect the OptiGrid
®
model that includes motorized focus control.
The following components are supplied with your OptiGrid
®
and are required for installation:
ɸ
OptiGrid
®
paddle
ɸ
OptiGrid
®
controller box
ɸ
USB cable
ɸ
Focus motor cable
ɸ
High voltage cable
The OptiGrid
®
controller box has a high-voltage output. The OptiGrid
®
controller box must be 
switched off before you connect the OptiGrid
®
paddle using the power switch which is on the front of 
the controller box. 
1. Connect one end of the high voltage cable to the OptiGrid
®
paddle and the other end to the Hi 
Voltage Output connector on the rear of the OptiGrid
®
controller box. 
2. Connect one end of the focus motor cable to the OptiGrid®® paddle and the other end to the 
MOTOR connector on the rear of the OptiGrid
®
controller box.
3. Connect one end of the USB cable to the USB connector on the rear of the OptiGrid
®
controller 
box and the other end to a spare USB port on your computer.
4. If you have a field stop (field diaphragm) installed in you microscope, remove it from the field stop 
port. 
Volocity Acquisition Installation and Reference
September 2011  190
5. Install your OptiGrid
®
in the field stop port. Your OptiGrid
®
“In” position can be found by pushing 
the OptiGrid
®
into the field stop port until the “clickstop” engages. In this position the OptiGrid
® 
should be visible in the ocular lenses or with the camera when fluorescence images are observed. 
The “Out” position can be found by withdrawing the OptiGrid
®
from the field stop port (disengaging 
the “clickstop”) until the grid is no longer in the light path, and no elements of the grid housing are 
in the light path. In this position the OptiGrid
®
can be left in the field stop port. 
6. Switch on the OptiGrid
®
controller box and start Volocity. The message “Connected to Volocity” 
will be displayed on the OptiGrid
®
controller LCD display.
7. You must now set up the OptiGrid
®
for use with Volocity. This requires you to set up the Device 
Preferences in Volocity and calibrate the OptiGrid
®
. .
Manual Focus Model
The manual focus model of the OptiGrid
®
is connected via the Improvision Acquisition Hub to the 
computer system that is running Volocity. 
The following components are required for installation:
ɸ
OptiGrid
®
paddle
ɸ
OptiGrid
®
controller box
ɸ
Improvision Acquisition Hub
ɸ
Blue BNC-RF cable
The OptiGrid
®
controller box has a high-voltage output. The Acquisition Hub and the OptiGrid
®
controller box must both be switched off before you connect the OptiGrid
®
paddle using the power 
switch is on the front of the Acquisition Hub and the OptiGrid
®
controller box. 
1. Connect the OptiGrid
®
paddle to the OUT HI VOLT connector on the rear of the OptiGrid
®
controller box.
2. Connect the BNC-RF cable to the INPUT connector on the rear of the OptiGrid
®
controller box 
Documents you may be interested
Documents you may be interested