mvc view to pdf itextsharp : Add text pdf acrobat control software utility azure windows web page visual studio 92015006333-part1605

Page 3
GRF1
RGC Ref No.d01825
(d) Special funding template (Applicants can select more than one box)
Application under the Clinical Research Fellowship Scheme (Please also
complete an additional form (Enclosure I) and see (Enclosure II)) (only available
for applications under Biology and Medicine Panel)
Application for individual research (see Enclosure III) (only available for
applications under Humanities and Social Sciences Panel and Business Studies
Panel)
Application for longer-term research grant (see Enclosure IV)
Application for employment of relief teacher under Humanities and Social
Sciences Panel (see Enclosure V) (only available for applications under
Humanities and Social Sciences Panel)
Application for provision of research experience for undergraduate student (see
Enclosure VI)
Appendix VI GRF proposal on GHK controlled release
Add text pdf acrobat - insert text into PDF content in C#.net, ASP.NET, MVC, Ajax, WinForms, WPF
XDoc.PDF for .NET, providing C# demo code for inserting text to PDF file
how to add text box to pdf document; acrobat add text to pdf
Add text pdf acrobat - VB.NET PDF insert text library: insert text into PDF content in vb.net, ASP.NET, MVC, Ajax, WinForms, WPF
Providing Demo Code for Adding and Inserting Text to PDF File Page in VB.NET Program
how to insert text box in pdf file; how to insert text into a pdf file
Page 4
GRF1
RGC Ref No.d01825
PART II     DETAILS OF THE RESEARCH PROPOSAL 
[To be completed by the applicant(s)]
RESEARCH DETAILS
1.     Impact and objectives 
(a maximum of 800 words for the long-term impact and project objectives)
(a) Long-term impact:
Key issues and societal relevance:
Anterior cruciate ligament (ACL) injury is a common sports injury in both professional
and recreational athletes. In the United States, around 200,000 cases of ACL ruptures
occur annually, causing a social cost exceeding half a billion US dollars. ACL
reconstruction (ACLR) is the usual approach to treat a ruptured ACL; in fact it is one of
the most commonly performed orthopedic surgeries worldwide. In Hong Kong, we have
around 1200 cases of ACLR annually. ACLR has a failure rate of 5% at the first year post
operation. Though there were numerous progresses in the surgical techniques in ACLR in
the past century, there are still substantial controversy and room for improvements,
particularly regarding a long and unpredictable healing and rehabilitation period, and
long term consequences of this injury such as early osteoarthritis. There is ample
emphasis on "mechanical" solutions to ACLR, such as double-bundle, fixation implants,
etc. BUT, none has addressed the importance of final incorporation of the "tendon" to a
"ligament". If this process can be further enhanced, it will reduce the time of maturation
of the graft, and hence earlier returns to full activities and sports.
Research question and hypothesis:
Numerous variables affect the success rate of ACLR, including the choice and size of
tendon grafts, graft tensioning and tunnel placement, fixation methods and rehabilitation
protocols. Research on the optimization of these variables is on-going, but poor intra-
tunnel graft incorporation and lengthy ligamentization still present major obstacles for a
predictable recovery. As both graft incorporation and ligamentization involve tissue
remodeling to transform an “ectopic” tendon graft into a viable ligament, biological
augmentation of tissue remodeling presents a plausible way to improve the healing
outcome of ACLR. Tissue remodeling starts with neovascularization and recruitment of
repair cells which mediate coordinated matrix degradation and matrix synthesis, leading
to restructuring of extracellular matrix. Glycyl-histidyl-lysine tripeptide copper complex
(GHK-Cu) is a well-known activator of tissue remodeling that can mediate a number of
remodeling-related processes, such as anti-inflammation, angiogenesis, chemo-attraction
of repair cells and stimulation of protein synthesis of extracellular matrix and proteolytic
enzymes. In the 1-year GRF project granted last year, we found that weekly intra-
articular injection (from 2-5 weeks post-op) of GHK-Cu can improve healing outcomes
in ACLR, including anterior-posterior knee laxity and graft incorporation inside bone
tunnel. However, the pull-out strength was not improved and the femur-graft-tibia
complex failed at mid-substance. We observed that repeated intra-articular injection may
have negative impact to graft survival such as sustained neovascularization in relation to
repeated trauma. Moreover, because of post-surgical inflammation and joint swelling,
Appendix VI GRF proposal on GHK controlled release
.NET PDF Document Viewing, Annotation, Conversion & Processing
Redact text content, images, whole pages from PDF file. Add, insert PDF native annotations to PDF file. Edit, update, delete PDF annotations from PDF file. Print
adding text box to pdf; adding text fields to a pdf
C# PDF Converter Library SDK to convert PDF to other file formats
Allow users to convert PDF to Text (TXT) file. can manipulate & convert standard PDF documents in other external third-party dependencies like Adobe Acrobat.
how to add text fields in a pdf; how to enter text into a pdf form
Page 5
GRF1
RGC Ref No.d01825
GHK-Cu treatment was started at 2 week post-op, yet graft deterioration may occur in
the first two week post-op. Therefore, we propose to develop a controlled delivery system
for GHK-Cu, to be applied intra-operatively as a bioactive coating on tendon graft in
order to reduce graft deterioration and enhance tissue remodeling. In a pilot study, we
showed that a collagen coating on tendon graft significantly reduce the extent of graft
deterioration. We hypothesize that a GHK-Cu-containing coating on tendon graft can
promote graft healing in ACLR.
Possible outcomes of the research project and clinical relevance:
The proposed investigation explores the NEW trend of "biological" enhancement of ACL
graft incorporation. The mode of application of GHK-Cu will be revolutionized by a
controlled delivery system, which also serves as a protective coating for the tendon graft
to endure the hostile post-surgical inflammatory phase. This graft vitalizing technology
will be applicable to both tendon allograft and autograft; and it may also be compatible
with artificial grafts as GHK-Cu modulates host responses for a better graft survival and
incorporation. Moreover, the development of controlled drug delivery system may be
useful for other orthopaedic surgeries for intra-operative administration of bioactive
agents. As there are over 1200 ACLR in Hong Kong per year, with over 200,000 ACLR in
US per year and possibly millions in the world; our study will not just benefit the
patients Hong Kong but worldwide. 
(b) Objectives
[Please list the objectives in point form]
1.   To fabricate thermo-sensitive hydrogels based on mPEG-PLGA-Box block copolymer
for bioactive graft coating. 
2.   To encapsulate GHK-Cu in the bioactive coating gel and investigate the release
kinetics. 
3.   To determine the effect of GHK-Cu bioactive coating on healing outcome after ACLR
in a rat model.
2. Background of research, research plan and methodology:
(A maximum of seven A-4 pages in total in Standard RGC Format for items (a) and (b))
(a) Background of research
(b) Research Plan and Methodology
Attached 7 pages(s) as follows
Appendix VI GRF proposal on GHK controlled release
VB.NET PDF: How to Create Watermark on PDF Document within
Using this VB.NET Imaging PDF Watermark Add-on, you simply create a watermark that consists of text or image And with our PDF Watermark Creator, users need no
add text to pdf acrobat; adding text to a pdf form
C# powerpoint - PowerPoint Conversion & Rendering in C#.NET
documents in .NET class applications independently, without using other external third-party dependencies like Adobe Acrobat. PowerPoint to PDF Conversion.
adding text to pdf; acrobat add text to pdf
GRF1 
RGC Ref No. 
GRF1 (ES Aug 09) 
2(a).   Background of research 
Work done by others: 
Problems to be solved in ACLR 
Currently there is a myriad of studies investigating improvements on surgical methods for ACLR, 
e.g. graft choices
20
, graft preparation and graft fixation
28
. Yet perfect surgical techniques still 
need  adequate  biological  healing  response  to  yield  good  clinical  outcomes.  Reports  have 
attributed poor graft healing as one of the causes leading to non-traumatic ACLR failure
21
. Graft 
healing of ACLR involves slow biological processes
25
, which are primarily attributed to tissue 
remodeling such as intra-tunnel graft incorporation and intra-articular graft ligamentization
40
. At 
the graft-tunnel interface, tissue remodeling is obviously inadequate to form mechanically stable 
connections. Ligamentization of the tendon graft is lengthy and graft integrity is compromised 
during  the  remodeling  process.  Moreover,  graft  deterioration  in  the  hostile  post-surgical 
inflammatory  phase  will  affect  the  tissue  remodeling  afterwards.  Therefore,  biological 
enhancement for a better healing outcome in ACLR should target on: 
1.  Protecting tendon graft from excessive deterioration during early healing phases; 
2    Promoting graft incorporation inside bone tunnels; 
3.  Accelerating  tendon  graft  ligamentization  without  compromising  mechanical 
properties of the tendon graft. 
Biological enhancement of healing at graft-tunnel interface 
Previous approaches to enhance  the healing at  the  graft-tunnel interface  includes the use of 
mesenchymal stem cell
26
, bone cement
24
, enhanced collagen composites
29
, and growth factors 
such bone morphogenetic protein 2
39
, transforming growth factor-
β1 and 
vascular endothelial 
growth factor
44
, and platelet-rich plasma
37
. These approaches generally focus on boosting up the 
bone formation, matrix synthesis and vascular supplies at the graft-tunnel interface, but graft 
survival and ligamentization are not specifically addressed. We need a new strategy of biological 
intervention that can promote graft remodeling (incorporation and ligamentization), and at the 
same time safeguard the mechanical integrity of the tendon graft. 
Regulation of tissue remodeling by matrikines 
Tissue  remodeling  in healing  process  refers  to  restructuring  of  extracellular matrix  towards 
functional, differentiated tissues from granulation mass. Matrikines are small peptides liberated 
by partial proteolysis of extracellular matrix macromolecules, which are able to regulate cell 
activities
27
. The crosstalk between cells and matrix by matrikines are particularly important in 
tissue  remodeling  which  involves  coordinated  matrix  synthesis  and  degradation.  Among 
different  classes of  matrikines,  Glycyl-Histidyl-Lysine  (GHK)  tripeptide  and  its  copper  (II) 
chelated form (GHK-Cu) exhibit profound involvements in the tissue remodeling processes
33
The tripeptide is found in low levels in human plasma and has a high affinity for copper (II) ions
32
. GHK have been extensively used in the cosmetic industry for skin tissue remodeling for years 
with  its  high  safety  profile  in  humans
31
.  GHK-Cu  can  simultaneously  activate  the in vivo 
synthesis  of  matrix  components,  such  as  collagen  synthesis  and  maturation,  and 
glycosaminoglycan  synthesis
43
, and  the in vivo  production  of  degradative  enzymes, such as 
metalloproteinases
41
,  and  the  inhibitors  of  such  enzymes,  such  as  tissue  inhibitors  of 
metalloproteinases
42
.
Since lysyl oxidase, the key enzyme that mediates formation of collagen 
crosslinks, is a copper-dependent enzyme; GHK-Cu may potentiate the copper bioavailability 
Appendix VI GRF proposal on GHK controlled release
C# Windows Viewer - Image and Document Conversion & Rendering in
standard image and document in .NET class applications independently, without using other external third-party dependencies like Adobe Acrobat. Convert to PDF.
add text to pdf; how to add text to a pdf in reader
C# Word - Word Conversion in C#.NET
Word documents in .NET class applications independently, without using other external third-party dependencies like Adobe Acrobat. Word to PDF Conversion.
add text pdf acrobat; adding text to a pdf document
GRF1 
RGC Ref No. 
GRF1 (ES Aug 09) 
and safeguard the healing process involving lyzyl oxidase as well as other copper-dependent 
enzymes such as superoxide dismutase. Apart from its effect on tissue remodeling, GHK-Cu can 
promote bone healing
34
and promote implant attachment to bony tissues
23
. It can also act as 
chemoattractant for repair cells and induce wound angiogenesis
38
. Therefore GHK-Cu may also 
be  beneficial  for  tissue  remodeling  in  ACLR  and  our  pilot  study  had  provided  supportive 
experimental evidence. 
Biomaterials for controlled drug delivery for orthopaedic applications 
Local  delivery  of  bioactive  agents  is  often  required  for  biological  enhancement  of  ACLR. 
Intra-operative implantation is only suitable for some treatments such as bone cement; while 
repeated intra-articular injection (eg. hyaluronan) may be employed for the bioactive agents to 
act for a longer period of time. Alternatively, bioactive agents with slow metabolizing rate or 
biomaterials  with  controlled  drug  release
36
can  be  used. Among  various biomaterials  being 
developed for controlled  drug delivery, temperature-sensitive  hydrogels 
30,35
may  be a  good 
option  for  intra-operative  administration  of  bioactive  agents. Temperature-sensitive  hydrogel 
undergo a volume phase-transition or a sol
gel phase-transition at a critical temperature, which 
could be engineered to fabricate a hydrogel that is in a solution state below the room temperature 
while gelling at body temperature. With its easy preparation, high encapsulation efficiency, and 
free of the harmful organic solvents in the formulation process, temperature-sensitive hydrogels 
are potentially useful for delivery of GHK-Cu to promote graft healing in ACLR. 
Work done by our group 
Clinical studies on ACLR 
Our clinical team operates more than 200 ACLR in Hong Kong annually. We are conducting 
some clinical studies on ACLR, such as comparison of ACLR with double bundles and single 
bundles;  and  development  of new  assessment  method  for  knee  stability  after  ACLR
11
. The 
participation of surgeons in the development of surgical procedures and knee laxity test in the 
animal model guaranteed the clinical relevance of the pre-clinical investigations in animals. 
Studies of tendon healing in a rat model of patellar tendon donor site injury 
We studied patellar tendon donor site injury in a rat model
up to 6 months post injury. In the rat 
model, various treatments to promote tendon healing were investigated
1,10
. On the other hand, 
regulation of tendon healing was also investigated in this model with respect to expression of 
TGF-beta isoform
3
and the changing cellular activities in different healing stages
7
. In summary, 
we established numerous techniques for histological, biochemical and mechanical assessments of 
tendon healing; some of these methods will be applicable for evaluation of tendon graft healing 
in ACLR. 
Studies of bone tendon junction healing in a rabbit model of partial patellectomy   
Our group has investigated the regeneration of bone tendon junction in a rabbit model
15
. We 
found  that  tendon-to-bone  healing  was  especially  weak  as  compared  to  interfaces  between 
tendon-to-cartilaginous bone surface
13
. The histological techniques developed for evaluation of 
regeneration of bone-tendon junction in this model will be adapted.   
Studies in rabbit and rat model of ACLR 
We have established a rabbit model of ACLR and investigated the bone remodeling process by 
Appendix VI GRF proposal on GHK controlled release
VB.NET PowerPoint: VB Code to Draw and Create Annotation on PPT
other documents are compatible, including PDF, TIFF, MS hand, free hand line, rectangle, text, hotspot, hotspot Users need to add following implementations to
add editable text box to pdf; adding text to pdf in preview
C# Excel - Excel Conversion & Rendering in C#.NET
Excel documents in .NET class applications independently, without using other external third-party dependencies like Adobe Acrobat. Excel to PDF Conversion.
add text pdf file acrobat; how to insert pdf into email text
GRF1 
RGC Ref No. 
GRF1 (ES Aug 09) 
microCT
12,18
. With the standardized protocols of image acquisition and analysis, we found that 
the peri-tunnel bone mass and connectivity may be good predictors for mechanical strength
16
We also investigated the effects of bone cement consisting of brushite calcium phosphate on 
intra-tunnel graft healing
17
. We showed that the healing capacity of femoral tunnel was inferior 
to that of tibial tunnel
19
, which is similar to the clinical settings. We also found that enveloping of 
graft with periosteum improved graft pull-out strength in rabbit model of ACLR
4
. It suggests that 
modification of surface properties of the graft can influence healing outcome in ACLR. With 
these investigations, we have established various experimental techniques to evaluate healing 
outcomes after ACLR such as mechanical test and micro CT evaluation. 
Apart from rabbit model of ACLR, we also successfully established a rat model of ACLR, with 
standardized procedure to apply graft tensioning and validated method of measurement for knee 
anterior-posterior laxity as a key outcome for ACLR
5
Studies on alterations in walking gait in ACL-deficient rats 
We have investigated changes in walking gait in rats with unilateral ACL transection (ACLT) and 
rats with ACLR. We observed pain-associated changes in limb idleness index (LII) in ACLT rats 
at 6 months post-op
8
, which was attributed to development of OA. In rats with ACLR at day 42 
post-op, LII was not significantly different from pre-injury level, but the ratio of knee AP laxity 
between injured and contralateral limb exhibited significant correlation to the ratio of paw print 
intensities  between  the  hind  limbs
6
.  It  suggested  that  gait  analysis  can be used  to  monitor 
functional changes in the rat model of ACLR. 
Studies of thermo-sensitive hydrogel and drug controlled release 
Our  group  developed  a  novel  biodegradable  thermo-sensitive  implant  composed  of  poly 
(ethylene  glycol)  monomethyl  ether  (mPEG)  and  poly(lactic-co-glycolic  acid)  (PLGA) 
copolymer as a sol-gel drug delivery system and its application to treat bone infection has been 
investigated
14
. The physical properties of a series of mPEG-PLGA nanocomposites, including 
the  critical  micelle  concentration  (CMC),  particle  size,  polyindex  (PI),  sol-gel  transition, 
viscosity and degradation rate, have been characterized in vitro. This sol-to-gel drug delivery 
system exhibit several advantages for bioactive coating on tendon graft in ACLR, such as easy 
preparation, 100% encapsulated rate, near-linear sustained release of drugs, injectable design and 
in situ gelling at body temperature in the target tissues. 
Pilot studies 
Graft deterioration after ACLR in a rat model 
The extent of graft deterioration after ACLR in a rat model of ACLR was examined by H&E 
histology with polarization microscopy (Figure 1). At day 1 post-op (a, b), the tendon graft 
appeared intact. At day 4 post-op (c, d), tendon graft looked laxer but the collagen birefringence 
was  still  normal.  At  day  7  post  injury  (e,  f),  loss  of  birefringence  was  evident  with  cell 
recruitment around the graft. At day 14 post injury (g, h), cell infiltration into graft was observed 
with further loss of birefringence. At day 42 post-op (i, j), significant graft remodeling with cell 
repopulation was observed. At day  84 post-op, the cellularity in  the  graft was decreased  as 
compared to day 42 post-op and the collagen birefringence slightly regained. The result showed 
that  graft  deterioration  was  active  at  the  first  2  weeks  post-op,  while  graft  remodeling 
(ligamentization) was slow and it was not completed even at day 84 (3 months) post-op in the rat 
model.   
Appendix VI GRF proposal on GHK controlled release
BMP to PDF Converter | Convert Bitmap to PDF, Convert PDF to BMP
Also designed to be used add-on for .NET Image SDK, RasterEdge Bitmap Powerful image converter for Bitmap and PDF files; No need for Adobe Acrobat Reader &
add text boxes to pdf document; adding text to a pdf document acrobat
JPEG to PDF Converter | Convert JPEG to PDF, Convert PDF to JPEG
It can be used standalone. JPEG to PDF Converter is able to convert image files to PDF directly without the software Adobe Acrobat Reader for conversion.
how to enter text in a pdf document; add text to pdf in acrobat
GRF1 
RGC Ref No. 
GRF1 (ES Aug 09) 
Effect of vitamin C irrigation saline on the healing outcomes of ACLR in a rat model 
We speculated that post-op inflammation and oxidative stress may exert negative impact to graft 
survival in ACLR. In a previously funded project (Innovation and Technology Fund 2009), we 
found  that  intra-operative  irrigation  of  vitamin  C  saline  significantly  improved  knee 
anterior-posterior laxity at day 42 post-op (Figure 2a), but the pull-out strength of the graft 
complex  was  not  improved (Figure 2b).  Vitamin  C  treatment  preserved  graft  integrity  as 
compared to the saline control (Figure 3), it suggested that modulation of early hostile local 
environment may influence the healing outcome of ACLR. 
Effect of GHK-Cu treatment on the healing outcomes of ACLR in a rat model 
From the pilot results of the 1-year GRF project we received last year, we found that weekly 
intra-articular injection of GHK-Cu (0.3 mg/ml) for 4 weeks (starting from 2 week post-op when 
joint swelling subsided) significantly improved restoration of knee AP laxity at 6 week post-op 
(Figure  4a). However, the pull-out strength was not improved  (Figure  4b). Histological 
examination showed that graft integrity was better preserved in GHK-Cu treated group (Figure5 
c, d) as compared to control group (Figure 5 a, b); and graft incorporation was also enhanced by 
GHK-Cu treatment (Figure 5 e, f)  as  compared  to  control (Figure 5 g, h).  Because  graft 
deterioration was active in first 2 week post-op and intra-operative treatment (i.e. vitamin C) 
could reduce graft deterioration, we speculated that extended GHK-Cu administration at first 2 
week post-op may be more effective to reduce graft deterioration. Intra-operative administration 
with controlled delivery of GHK-Cu may be a plausible strategy. 
Effect of protective coating on the graft deterioration in a rat model of ACLR 
In an attempt to reduce graft deterioration, we applied a collagen coating on the tendon graft by 
soaking the graft with 6 mg/ml bovine type I collagen solution. Histological examination was 
carried out at week 2 post-op (when significant graft deterioration occurred). We found that 
coated tendon graft still retained typical birefringence (Figure 6 c, d) as compared to uncoated 
control (Figure 6 a, b). However, the coated tendon graft did not showed obvious improvement 
in graft incorporation at 2 week post-op (Figure 6 g, h) as compare to control (Figure e, f). This 
observation supports the idea to develop a bioactive coating for tendon graft, in order to reduce 
graft deterioration and enhance tissue remodeling in ACLR for a better healing outcome. 
2(b). Research plan and methodology 
Objective 1:  To  fabricate  thermo-sensitive  hydrogels  based  on  mPEG-PLGA-Box  block 
copolymer for bioactive graft coating. 
A series of mPEG-PLGA-Box block copolymer will be synthesized according to previous work 
14
(A). The copolymers (4
°
C) will be applied on the surface of rat flexor tendon graft and the 
thickness of the coating will be assessed by high resolution 3-D ultrasound imaging. Stripping 
test (threading through 1.2 mm diameter bone tunnel) will be performed to determine how much 
coating was retained during surgical fixation (B, C).   
Group  mPEG/PLGA ratio 
copolymer concentrations 
Assessments 
1-3 
550-1030 
15, 20, 25 % 
Stripping test with ultrasound imaging 
+histology (n=6) 
4-6 
550-1105 
7-9 
550-1405 
9 groups x 6 tendons per group = 54 flexor tendons. 27 rats will be used. 
Appendix VI GRF proposal on GHK controlled release
GRF1 
RGC Ref No. 
GRF1 (ES Aug 09) 
Objective 2:  To encapsulate GHK-Cu in the bioactive coating gel and investigate the release 
kinetics   
Encapsulation of GHK-Cu will be performed in a similar procedure as described in previous 
work for encapsulation of teicoplanin
14
, with the chosen copolymer concentrations specified in 
the study for objective 1. The GHK-Cu encapsulated copolymer will be allowed to form a thin 
coating on plastic beads. The coated plastic beads will  be used for investigation of in vitro 
degradation of copolymer and in vitro release kinetics as described previously. GHK-Cu will be 
determined by UV spectrophotometry (D)
Objective 3:  To determine the effect of GHK-Cu bioactive coating on healing outcome after 
ACLR in a rat model.   
The  effect  of  GHK-Cu  bioactive  coating  on  graft  healing  will  be  investigated  in  a 
well-established rat model of ACLR (E). Two doses of initial GHK-Cu loading on the coating 
will be tested, as compared to the groups with coating only and without coating.   
Group  Treatment 
Assessments 
3.1 
Control without coating 
1.  Histology (n=4). Sampling at week 2, 6 & 12 post-op, 
n=12 per group 
 
H&E; immunohistochemistry 
(F)
2.  Mechanical test and gait analysis (n=8)
Sampling at 
week 12 post-op, n=8 per group 
 
Knee laxity test 
(G)
, graft pullout test 
(H)
 
Gait analysis (pre-injury, week 6, 12) 
(I)
3.2 
Control with coating only 
3.3 
Bioactive coating with 0.3 mg GHK-Cu 
3.4 
Bioactive coating with 3 mg GHK-Cu 
Total number of animal: 80 rats.   
Total number of rats in the whole study: 80+27 rats = 107 rats + 10 % buffer= 120 rats 
Methodology 
A.  Fabrication of temperature-sensitive collagen-based hydrogel for bioactive graft coating 
A  series  of  the  monomethoxypoly(ethylene  glycol)-co-poly(lactic-co-glycolic  acid) 
(mPEG-PLGA)  diblock copolymers were  synthesized by the ring-opening polymerization  of 
methoxypoly(ethylene  glycol),  D,L-lactide,  glycolide  in  the  presence  of  stannous 
2-ethylhexanoate, crosslinked with 2,2-bis  (2-oxazoline)
14
. A typical synthetic procedure was 
shown  in Figure 7.  The  chemical  structures  were  identified  by 
1
H  NMR.  Not  only  phase 
transition  behavior  but  also  a  lower  critical  solution  temperature  (LCST)  was  observed. 
Physico-chemical  characterization  has  been  evaluated  in  our  previous  study,  including  the 
thermo-sensitive behavior, critical micelle concentration (CMC), particle size of micelle, and the 
biodegradability
14
. The co-polymers will be used to apply a bioactive coating in this project. 
B.  Impregnation of bioactive coating on tendon graft 
A fixed volume of cold aqueous solution of diblock copolymers (4
°
C) will be applied on the 
surface of rat flexor tendon graft (freshly harvested with sutures on both ends) and keep for 10 
minutes at 37
°
C. The thickness of the coating will be assessed by high resolution 3-D ultrasound 
imaging  (before  coating,  after  coating  and  after  stripping)  and  confirmed  with  coronal 
histological sections of the tendon samples. Stripping test (threading through 1.2 mm diameter 
bone tunnel) will be performed to determine how much coating was retained. The copolymer and 
coating conditions will be optimized to attain at least a 50 micron-thick coating. 
C.  High resolution ultrasound imaging 
Appendix VI GRF proposal on GHK controlled release
GRF1 
RGC Ref No. 
GRF1 (ES Aug 09) 
3-D ultrasound images of the flexor tendons will be taken by the high resolution ultrasound 
imaging system (Vevo 770, Visualsonics, Toronto, Canada) under fixed tension (0.5 N), and the 
volume of the tendon samples (the segment between the sutures of proximal and distal ends) will 
be  measured (Figure 8)  before  coating,  after  coating  and  after  stripping.  The  average 
cross-sectional area (CSA) will be obtained by dividing the tendon volume with the segment 
length. The estimated thickness of the coating will be calculated from the difference of CSA 
relative to the pre-coating values. 
D.  In vitro test for release kinetics 
GHK-Cu will be added  to 15 wt%-, 20 wt%- and 25  wt%-copolymer  aqueous solution and 
homogenized  with  Vortex  mixer  for  1  min  at  4
°
C.  The  final  concentration  of  GHK-Cu  in 
copolymer solution will be either 0.3 or 3mg/ml. GHK-Cu -containing copolymer will be coated 
on plastic beads (diameter 1 mm). After gelation at 37 
°
C for 5 min, the coated beads will be kept 
in 10 ml vial and 9 ml PBS will be added into the vial as release medium and maintained at 37 
°
C in a thermostatic bath with shaking for 50 rpm. The release media will be collected from the 
vial every 3 days (up to 30 days) for analysis of GHK-Cu released from the beads. Released 
GHK-Cu will be quantified by UV spectrophotometry at 237nm 
22
E.  ACL Reconstruction 
The surgical procedures will be adapted from our previous studies
5,6
and approved by the Animal 
Research Ethics Committee under the support of the University  Laboratory Animal Services 
Centre. Male SD rats at 12 weeks old will be used. Under general anaesthesia, the rat will be 
operated unilaterally in a  randomly selected limb. The flexor  digitorum longus tendon  graft 
(20mm in length and 1mm in diameter) is harvested from a longitudinal medial incision. Graft 
coating will be done by impregnating the graft with GHK-Cu-loaded or unloaded copolymer for 
10 minutes at 37
°
CMeanwhile, the intact ACL is excised and the successful excision will be 
confirmed by a positive Lachman test. Tibial and femoral tunnels, both with 1.2 mm diameter 
and 6 mm in length, are created from the footprint of the original ACL to the medial side of tibia 
and the lateral femoral condyle respectively, with an angle of ~55
o
to the articular surface. After 
rinsing the debris with saline, the graft is inserted and routed through the bone tunnels, and fixed 
on both tunnel exits with suture tied over the neighboring periosteum. The fixation of graft at 
femoral end is performed under a 4N tensioning with the knee fully  extended. Soft tissue is 
closed in layers. The animals are allowed for free cage activity after operation. 
F.  Histological assessments 
Paraffin-embedded sagittal sections are prepared from formalin-fixed and formic acid-decalcified 
rat knee samples. H&E staining is performed to examine graft integrity in intra-articular space, 
tibial  and  femoral  tunnels,  as  well  as  graft  incorporation  inside  bone  tunnel.  Polarization 
microscopy  is  used  to  examine  collagen  birefringence  in  the  tunnel-graft  interface. 
Immunohistochemistry is performed according to our previous studies
3,9 
. Neovascularization 
will  be  assessed  by  CD31  staining,  while  cell  recruitment  and  proliferation  in  the  graft  is 
identified by PCNA and 
SMA staining.   
G.  Static knee AP laxity test 
The laxity test is performed on a mechanical testing machine (Tinius Olsen, UK) as described in 
our recent report
5
with a 50 N load cell. The whole rat knee is harvested with joint capsule and 
all ligaments and patellar tendon kept intact. Muscles  around the femur and  tibia shafts  are 
removed to enable fixation by adhesive polymer (Forecast, polyurethane casting system, Ciba 
Specialty Chemicals, HK). The knee is mounted on a custom-made testing jig at 70
°
flexion, 
with the axial rotation and varus-valgus angulation maintained at natural unconstrained position. 
Appendix VI GRF proposal on GHK controlled release
GRF1 
RGC Ref No. 
GRF1 (ES Aug 09) 
Similar  to  the  operation  of  KT-2000  knee  joint  anthrometer,  the  tibia  side  is  moved  from 
posterior to anterior direction along the anterior-posterior (AP) axis of the knee at a constant 
speed of 20mm/min until a 10 N loading range is reached. Static AP laxity of the sample is 
measured as the resultant AP displacement at 1 N range around the inflection point of the force 
displacement curve.   
H.  Graft pull-out test
5
After the static AP laxity test, the knee is trimmed to obtain the femur-ACL graft-tibia complex. 
The sutures for graft fixation are removed. The femur and tibia are mounted to the jigs in new 
positions to align the ACL graft to the tensile loading. The complex is preconditioned by cyclic 
loading to a maximum load of 0.5 N for 5 cycles, and then the ACL graft is stretched at a speed 
of  40 mm/min until  graft pullout or  graft failure.  Both the load at failure and  stiffness are 
measured from the force displacement curve and the failure mode is recorded. 
I.  Gait analysis 
Functional recovery of ACL reconstructed rats will be assessed by motion analysis with Catwalk 
XT 9.0  system (Noldus Technology, the Netherlands) according  to our previous  protocol in 
examining  ACL  deficient  rats
8
.  Rats  will  be  placed  onto  a  walkway  and  allowed  to  walk 
voluntarily in dark. Illuminated contact paw prints will be captured automatically by a 100Hz 
camera. Three to five compliant runs with average speed variations <30% will be analyzed. A 
Limb Idleness Index (LII) of the operated limb will be calculated as a product of target print ratio, 
anchor print ratio, and swing duration ratio.   
J.  Statistical analysis 
All Statistical analysis will be performed using the Statistical Package for Social Sciences (IBM 
SPSS Ver. 20).  Different  experimental  groups  will be  compared  by  one-way  ANOVA  after 
checking for normal distribution with Kolmogorov-Smirov test and equal variance with F-test, 
otherwise, a non-parametric Kruskal-Wallis test will be used. Newman-Keuls post-hoc tests were 
applied where appropriate. Statistical significance will be accepted at 
= 0.05. 
K.  Estimation of sample size and power 
When the sample size in each of the 4 groups (for study in objective 3) is 8, one-way ANOVA 
will have 90% power to detect at the 0.050 level an effect size of 0.5101 (nQuery Advisor 3.0). 
With our previous studies on mechanical test 
5,18,
(n=6) and gait analysis
8
(n=6), the common SD 
are around 20-30 % of the means respectively.   
L.  Publication plan and schedule of research work 
Based on the results of the present proposal, 3 conference papers will be submitted to Annual 
Congress of the Hong Kong Orthopaedic Association (HKOA) 2014, International Symposium 
on Ligaments and Tendons (ISL&T) 2015, and Annual Meeting of Orthopaedic Research Society 
(ORS) 2015 within 2 years. The research projects will yield 3 journal papers. Inter-rim progress 
reports and final report will be submitted according to the requirement of RGC.
Appendix VI GRF proposal on GHK controlled release
Documents you may be interested
Documents you may be interested