pdf viewer c# winform : Add jpg signature to pdf control Library utility azure .net html visual studio parrishfull3-part2236

Other asymmetric structures derive from the cleavages of small proportions (5-20%) of the proteins within the 
capsid.  Some cleavages that would affect both antibody and TfR binding occur within surface loop 3, and 
those differ in susceptibility in different viruses due to differences of VP2 residues 297 and 300 and by other 
residues (45).  Only 5-20% of the proteins become cleaved even after extensive digestion, suggesting there is 
pre-existing variability in the structure of that loop, or that a structural change occurs in the capsid after 
cleavage of some sites which prevents cleavage of further sites.  Those cleavages are within the binding sites 
of the TfR and of many antibodies that bind the “B” antigenic site in the capsids (21), and those would show 
different binding properties to both ligands compared to the uncleaved structures.  Another cleavage occurs at 
Lys 271 on the inside of the capsid, between two unbonded cysteines (Cys270 and 274), and in the vicinity of 
a small di-S bonded loop between Cys490 and 494.  Although of unknown function, that cleavage is beneath 
the threefold region of the capsid and its greatest effect would likely be to alter the stability of the capsid or the 
DNA packaging. 
C1b)  Studies of capsid structures, and the role of capsid protein flexibility. 
C1b1) Mutations that affect capsid flexibility.
We have seen that capsid substitutions that affect important 
functions often cause only small changes in the viral structures determined by X-ray crystallography (2, 20, 40, 
60, 64).  However, those were often associated with changes in protein flexibility – of all 60 sites in the capsid, 
or within a subset of the capsid subunits.  For example, substitutions within 3 of the 4 surface loops affect both 
TfR and antibody binding - in loop 1 residue Lys93 cross links to another loop in the VP2 and results in 
stabilization, while Asp93 or Asn93 do not; in loop 3 residues Gly299, Ala300 or Gly300 do not form H-bonds 
to other structures, while Glu299 or Asp300 would H-bond with Arg81; Asp323 forms a bond with Arg377, 
while Asn323 does not.  Those viruses with single changes can be used in our studies of receptor and 
antibody binding, in addition to other variants that affect the structure (see below). 
C1b2)  Role of divalent ions controlling the parvovirus capsid structure.
Many different viruses bind ions 
within their structures, and in some cases those control “switches” between different structures.  CPV and FPV 
capsids bind and release two or three divalent ions within each capsid subunit (giving 120 to 180 ions per 
capsid), and we have determined the crystal structures of capsids with varying numbers of ions bound, and 
showed that those stabilize two loops in the capsid (60).  This may be a common mechanism in parvoviruses, 
as in MVM it has recently been shown that ion binding in the capsid affects DNA packaging and release (13).  
We can remove or prevent ion binding by 
chelation, incubation at low pH, or by 
mutation of the residues involved in 
coordinating the ions.  The 3 Ca
2+
per 
capsid subunit in CPV (and the 2 Ca
2+
in 
FPV) are coordinated by groups of 
surrounding Asp and His residues 
(Fig. 
1)
.  To test for effects of the ion binding on 
the viral functions, we would modify 
individual Asp or His residues to Asn or 
Ala, in order to change the charge and 
prevent the coordination of one or more of 
the ions.  Those changes would be made 
in infectious clones of CPV or FPV, and 
the viruses tested for viability, as well as 
for structure and functions as described 
below. 
C1b3)  Examining capsids for submolar variation – protease cleavages and exposed structures.
C1b3a) Role of VP2 to VP3 cleavages in viral capsid structure and functions.
This cleavage occurs only in full 
capsids, and in CPV and similar parvoviruses involves removal of 15 to 24 residues (45).  The N-termini of a 
proportion of the VP2 must fill the channels at the fivefold axes of symmetry, and that may prevent initiation of 
packaging the viral DNA at more than 1 site.  VP2 N-terminal sequences also influence nuclear export of the 
full particles after production (42).  Cleavage of the VP2 to VP3, along with Ca
2+
removal, would favor DNA 
release (13).  We would examine the effects of the N-terminal sequences on the structure and permeability of 
the capsids by digesting the capsids with trypsin (which cuts after residue 19) or with subtilisin (which cuts after 
residue 24) at 37°C, converting ~80% of the VP2 to VP3.  After adding proteinase inhibitors the capsids would 
be isolated by gel chromatography and examined for changes in the particle stability by spectrofluorometry, 
Fig. 1.
The CPV capsid structure showing the position of one 
VP2 molecule.  The blow-up shows the positions of three 
divalent ions (most likely Ca
2+
) that are bound in the structure, 
and the residues that coordinate them. 
Research Strategy                                                                                             Page 34
Principal Investigator/Program Director (Last, first, middle): Parrish, Colin, R.
Add jpg signature to pdf - insert images into PDF in C#.net, ASP.NET, MVC, Ajax, WinForms, WPF
Sample C# code to add image, picture, logo or digital photo into PDF document page using PDF page editor control
adding images to pdf files; add image to pdf online
Add jpg signature to pdf - VB.NET PDF insert image library: insert images into PDF in vb.net, ASP.NET, MVC, Ajax, WinForms, WPF
Guide VB.NET Programmers How to Add Images in PDF Document
add jpg to pdf form; adding a png to a pdf
tested for altered DNA exposure properties, and for their ability to bind the TfR and infect cells, as detailed 
below. 
C1b3b) Antibody detection of the VP1 N-terminus, or of variable and internal capsid peptides.
We have 
antibodies that recognize capsid sequences that are normally buried but that become exposed under different 
conditions.  Those include MAb against the VP1 N-terminal sequences, anti-peptide antibodies against 
sequences on the inside of the capsid (VP2 residues 258-270), against peptides surrounding the fivefold pore, 
and MAbs that recognize the variable loop between residues 362-373 in the capsid, the structure of which is in 
part controlled by bound Ca
2+
(60, 70, 74).  Those antibodies would be used to directly detect those peptides in 
capsids in ELISA, where the amount of binding would be proportional to the amount of peptide exposure.  
Another assay would use the antibodies to immune precipitate the capsid - where the amount of VP2 
recovered would represent the proportion of particles that had the specific peptide exposed.  The latter assay 
would be particularly sensitive for peptides or structures that are present at low numbers or transiently revealed 
on the capsids. 
C1b3c) Cleavage of residues in surface loops - a control of variable TfR and antibody binding?
The role of 
surface cleavages would be examined using several approaches: comparing cleaved and uncleaved capsids, 
altering the known cleavage sites, or by preparing new cleaved forms of the capsids by introducing additional 
digestion sites. Cleavages in loop 3 are controlled by VP2 residues 297 and/or 300; when residue 297 is an 
Ala the protein is not cleaved, 
while the Ser form is cut in 10-
20% of the capsid proteins 
(45).  Residue 300 also 
controls cleavages, as the Ala 
form is cleaved, while the Asp 
or Gly forms are not 
(Fig. 2)
.  
CPV mutants with Asp300 or 
Glu299 also do not bind the 
canine TfR and are therefore 
altered in canine host range, 
and also differ in antigenic 
structure.  From the atomic 
structure of the Asp300 
mutant, it is seen that the 
charged side chain forms a H-bond with Arg87 to stabilize that loop (and Glu299 also likely forms a similar 
bond), and that also likely prevents virus interaction with the canine TfR (27, 40). 
We would therefore prepare mutants of several positions within loop 3 to increase or reduce the flexibility and 
cleavages of that structure. Those would include changes of residues 297, 299, 300, and 301 which prevent or 
allow cleavage, or change inter-chain bonds, depending on the specific residue introduced.  To increase 
cleavage susceptibility over the wildtype level, we would also introduce basic sequences that would be 
susceptible to trypsin or to furins on the cell surface. Mutants would be tested for viability, for feline and canine 
TfR binding, and for antibody binding and neutralization by Fabs with different specificities. 
C1b3d) The cleavage of VP2 residue Lys271
.
This cleavage occurs in ~10% of the VP2 at Lys271 on the inner 
face of the capsid, and may be due to an intercellular proteinase or possibly to a previously unrecognized 
autocatalysis.  After cleavage the new N and C termini would likely separate and change the capsid structure 
in the vicinity of the packaged DNA, and the Cys270 and Cys274 may be able to form a new diS bond.  To 
investigate any functions associated with that cleavage, we will change residue 271 from Lys to Ala (or Arg), 
and would test the mutant virus for the formation of the cleaved protein and for any changes in the viral relative 
infectivity and particle stability.   
C1b3e) Testing the functions of mutant capsids.
Capsids with different proportions of surface loop cleavages 
or Ca
2+
bound would be tested for affinity and levels of binding to purified TfR ectodomains, to TfRs expressed 
on cells, and for binding to antibodies with different specificities, using standard methods used in our laboratory 
(19, 21, 45, 46, 49).  Capsids would be examined for the numbers of TfRs bound in biochemical assays of the 
complexes, or by using negative staining EM to estimate the number of TfR bound, which is possible due to 
the large size of the TfR relative to the capsid (22, 49).  The binding of Mab-derived Fabs that we know attach 
over the positions that are cleaved would be examined and the relationship to TfR binding would be examined 
as described below (Section C2b1 and C3b).   
Fig. 2. 
The differential susceptibility of CPV with Ala300, or Asp300 to 
to 
digestion with proteinase K.  The cleavage introduced by the proteinase in a 
proportion of the VP2/VP3 in the wildtype (Ala) is marked with the arrow. 
Research Strategy                                                                                             Page 35
Principal Investigator/Program Director (Last, first, middle): Parrish, Colin, R.
JPG to JBIG2 Converter | Convert JPEG to JBIG2, Convert JBIG2 to
original images without any affecting; Ability to convert image swiftly between JPG & JBIG2 in Also can be used as add-on for RasterEdge .NET Imaging SDK. Start
add image to pdf acrobat; add photo to pdf online
JPEG Image Viewer| What is JPEG
JPEG, JPG. excluded in the standard RasterEdge .NET Imaging SDK, you may add it on images into other file formats, including Bitmap, Png, Gif, Tiff, PDF, MS-Word
how to add an image to a pdf in reader; add an image to a pdf with acrobat
C1b3f) DNA exposure in full particles.
For full particles the exposure or release of DNA occurs during 
infection.  To test for changes in the DNA exposure, wild type or mutant capsids would be examined, and 
capsids bound to wild type or mutant TfRs, or treated with proteases or with Ca
2+
removed.  The 3’ end of the 
viral DNA can be exposed without particle disintegration, and we would detect that release by using it as a 
template for synthesis with the T7 DNA polymerase.  Synthesis initiates on the 3’ DNA hairpin, so that DNA 
synthesis is proportional to the amount of the 3’ hairpin exposed (13, 74).  The capsids would be incubated 
with T7 polymerase and dNTPs, and the amount of product determined by incorporation of 
32
P- or Cy5.5-
labeled nucleotides which would indicate the degree of 3’-end exposure.   
The 5’-end of the DNA is exposed on the outside of the full capsid, with the NS1 protein attached to that DNA 
in newly-made particles.  We would detect the NS1-associated with the capsid using the gold labeled Fab of 
the CE10 antibody against NS1 protein, and examine in EM.  We can also detect the 5’ end of the DNA directly 
using an hnRNP A/B protein that recognizes a sequence close to the 5’-end of the viral DNA that is exposed 
on the outside of the capsid (68).  That protein would be purified and gold labeled, then used to detect the DNA 
on the outside of the capsid.  The protein binds close to the surface of the capsid, and should be tightly 
localized adjacent to the capsid.  After initially screening the binding by negative staining, cryoEM analysis 
should allow the position of DNA exposure to be seen, most likely at or adjacent to a fivefold axis of the capsid. 
C1b4) Dynamic properties of digested or mutant capsids.
For the cleavage site variants and Ca
2+
binding 
mutants, protease treatments and probing with a large panel of specific Mab will be used to examine for 
changes in the structure.  Capsid stability can be measured by resistance to heating, either testing for effects 
on infectivity, or by changes in Trp fluorescence using spectrofluorometry, as we have described previously 
(45).  The level of cleavage would be determined by SDS-PAGE analysis after protease treatments.  To 
confirm the sites of cleavage seen, we would use micro-N-terminal sequencing or size analysis by mass 
spectrometry.  We would particularly focus on cleavages generated during limited digestions, which would 
show the structures within the capsid that are changing in conformation.   
C1b5) Receptor binding properties of the mutant or digested capsids
.
We would determine the binding affinity 
of wildtype or variant capsids to the cell receptors (19, 49).  Plasmid expression efficiently displays the receptor 
on the surface of TfR-negative TRVb cells, and we can also readily purify TfR ectodomains after expression in 
insect cells from baculoviruses (49).  The purified TfRs bind the capsids in vitro with similar relative affinities to 
those seen for the same receptors expressed on cells (49).  To measure the affinity of virus binding to the 
wildtype TfR or mutants we would also use flow cytometry to measure binding and release of capsids to the 
receptors expressed on cells.  In an alternative solid-phase binding assay, the His-tagged TfR ectodomain 
would be immobilized on lipid bilayers with Ni
2+
-NTA, and fluorescently labeled capsids flowed over the 
receptor layer.  Labeled viruses would be followed by fluorescent microscopy using TIRF, and the on- and off-
rates determined directly, allowing the affinity of binding to be determined directly (9).  Additional studies are 
described in Section C2, below. 
C1b6) Changes in capsid permeability.
Changes in capsid permeability are associated with several structural 
changes in the virus, including cleavage of VP2 to VP3 in full capsids, the release of the VP1 N-termini from 
inside the capsid, and the release of the 3’-end of the viral DNA (see above).  Some or all of these releases 
occur through pores at the 5-fold axes of symmetry.  Capsid 
permeability can therefore be increased by mutations in the 
loops surrounding the pores at the fivefold axes of 
symmetry.  We already have mutants of residues involved in 
the stabilizing the pore structure (“gatekeepers”) including 
Asn167Ala, Asp168Ala and Thr170Ala, and those capsids 
would be examined for their permeability and the degree of 
exposure of the VP2 and VP1 N-termini or DNA under mild 
heating or other conditions.  The permeability of empty 
capsids can be semi-quantitatively monitored using negative 
staining EM at neutral pH.  Stains with differing properties 
include methylamine tungstate (NanoW), ammonium 
molybdate, uranyl acetate, NiSO
4
, and sodium tungstate.  NanoW does not enter intact empty particles at 
neutral pH, but can enter after different treatments, while NiSO
4
readily enters empty particles under most 
conditions (45) 
(Fig. 3). 
We would therefore examine the various mutant capsids under controlled conditions 
including heating, protease digestion, and receptor or antibody binding.  For empty particles we would 
Fig. 3.  
Assessing the penetration of capsids 
using NanoW or NiSO
4
, distinguishing the 
different particle forms; NanoW will penetrate 
empty particles after various treatments. 
Research Strategy                                                                                             Page 36
Principal Investigator/Program Director (Last, first, middle): Parrish, Colin, R.
XDoc.HTML5 Viewer for .NET, All Mature Features Introductions
and Communications in Medicine; Raster Image Files: BMP, GIF, JPG, PNG, JBIG2PDF NET document and image viewer allows users to add various annotations Signature.
add an image to a pdf acrobat; add signature image to pdf acrobat
VB.NET PDF Convert to Images SDK: Convert PDF to png, gif images
Create image files including all PDF contents, like watermark and signature. Convert PDF to Jpg, Png, Bmp, Gif, Tiff and Bitmap in ASP Add necessary references:
adding an image to a pdf file; add image to pdf preview
particularly examine the penetration of NanoW, carefully examining the capsids by electron microscope and 
the proportion of penetrated particles determined.   
C1c)
Outcomes, potential problems and difficulties, and alternative approaches
The goals of this first section are the characterization of any important variation, flexibility, and asymmetry in 
the parvovirus capsid structures, and effects on capsid permeability and the exposure of internal components 
important for infection.  Structural variation clearly occurs in the capsid, and many of the variants or mutants 
we will be examining are already known to show differences in flexibility and/or protease cleavage 
susceptibility.  The effects of structural changes on the capsid functions are harder to predict, but functions 
known to be altered include the affinity of receptor binding (in particular the host-specific binding to the 
glycosylated canine TfR), as well as sialic acid binding, antibody binding, and exposure of various peptides and 
of the viral DNA.  Receptor binding will also be examined in detail in the experiments in Section C2, and the 
relationships between antibody and TfR binding will be examined in Section C3. 
There are some potential challenges in these analyses of the capsids.  First, we cannot predict the functional 
effects of some of the structural changes, and some effects may be relatively subtle.  It is clear that the capsids 
act as finely regulated machines and perform their functions through controlled transitions, and do not (for 
example) simply fall apart, even to release the DNA, but likely expose internal structure or the DNA 3’-end only 
under controlled circumstances during infection.  Asymmetry can be difficult to detect and quantify, but in this 
system we should be able to detect that using a variety of biochemical or other approaches. We know some of 
the capsid changes that control protease cleavages and can use that information to predict alternative sites, 
and have enough preliminary information to be able to prepare informative mutants for our functional analyses.  
The divalent ion binding sites are well defined from the X-ray structures, as are natural mutations are known 
that prevent one ion binding and also increase the flexibility of the adjacent loop that controls sialic acid binding 
(60).  Altering the binding sites of the other two ions is quite straightforward, although we do not know if 
capsids with mutations affecting the binding of those ions will be viable.  However, we can also control ion 
binding by chelation with EDTA or EGTA, or by incubation at low pH, so there are several alternative 
approaches available.  If mutant viruses are non-viable, we can test many functions by expression of capsids 
by plasmid transfection or by expression from baculoviruses (58). 
C2)
Aim 2.
To define the structural interactions between various parvovirus capsids and variants of 
the transferrin receptor or artificial receptors.
Hypothesis: That specific binding of capsids to the feline or 
canine TfRs is required for successful cell infection, and those interactions are controlled by viral structures 
varying in structure and flexibility.
C2a) Background on receptor and capsid structures involved in binding.
The FPV and CPV capsids bind the TfR on the surface of their host cells, and it appears that specific TfR-
capsid interactions are required for infection, as other ligands that bind the virus at the cell surface and mediate 
uptake do not result in infection (26).  The TfR is large butterfly shaped homodimer (11nm span), where each 
monomer is comprised of protease-like, apical and helical domains 
(Fig. 4)
.  While FPV and CPV both bind the 
feline TfR, only CPV binds the canine TfR, an interaction that was critical for the host range shift of CPV (53).  
We have prepared a low resolution structure of the feline TfR:capsid structure determined by cryoEM which 
shows the footprint of 
the feline TfR on the 
capsids (22), and have 
also defined sites on 
the receptor that control 
interactions with the 
virus (19, 49, 50).  The 
canine TfR has a 
distinct interaction with 
the CPV capsid 
compared to the feline 
TfR, as many viral 
changes that alter 
canine TfR binding do 
not change feline 
receptor binding (25, 
51).  Mutational studies 
Fig. 4.
.
The TfR structure, based on a model of the human receptor (domains are 
colored on one monomer – protease-like = red, apical = green, helical = yellow).  
Residues tested for effects on the binding of CPV are colored: no clear effect on 
virus binding dark blue, alteration of virus binding red or purple.  Known Asn-
linked glycosylation sites labeled in orange.  A portion of the stalk domain is 
colored in cyan (left), and transferrin binding sites are brown (right). B) The 
position of residue Leu 221 in the apical domain. 
Research Strategy                                                                                             Page 37
Principal Investigator/Program Director (Last, first, middle): Parrish, Colin, R.
JPEG to PDF Converter | Convert JPEG to PDF, Convert PDF to JPEG
similar software; Support a batch conversion of JPG to PDF with amazingly high speed; Get a compressed PDF file after conversion; Support
add image to pdf; add image field to pdf form
JPG to DICOM Converter | Convert JPEG to DICOM, Convert DICOM to
Image Converter Pro - JPEG to DICOM Converter. Convert JPEG (JPG) Images to, from DICOM Images on Windows.
add an image to a pdf form; add picture to pdf form
of the feline and canine TfRs have defined receptor residues that control virus binding (19, 49, 50), and those 
show that one site is particularly critical for the interaction.  When that site was changed to the other amino 
acids, a series of receptors with single changes were obtained that varied in affinity of binding, from no binding, 
low binding, to close to wild type (19).  Those mutant TfRs are all available for the proposed studies.   
These studies will provide fundamental information about the processes of receptor-virus interactions.  In the 
case of TfR, the rodent TfR-1 is used for cell binding and infection by New World arenaviruses and by mouse 
mammary tumor virus, and those viruses also bind to the apical domain of the receptor, in some cases 
interacting with the same residues in the structure as CPV (1, 69).  While the normal function of the apical 
domain is unknown, we have examined TfR sequences from many different large and small cats which likely 
have been infected by FPV for very long periods, and have identified a region in the apical domain with 
substitutions of residues 378 (Gln-Arg), 379 (Asn-Ile), and 380 (Trp-Ser) within the virus binding region, that is 
clearly under selection, perhaps by the virus.  Those changes will therefore also be tested in our future studies 
to see whether they affect virus binding and infection. 
C2b) How does capsid bind the TfR, and is that specific interaction important for infection of cells?  
We will further define the TfR-capsid interactions by analysis of the receptor and viral structures using a variety 
of approaches to alter the viral and TfR structures involved in the interaction, to explain how the functional 
contacts are controlled, and the effects on binding or infection of the structural variants being examined.  In 
addition to studying specific mutants we will also prepare higher resolution cryoEM structures of various TfR-
capsid complexes.  The overall goals are to create a complete dynamic structural model of the interaction that 
explains the functions in binding and infection.  
C2b1) Defining the functional capsid-TfR interactions.
We have 
identified several residues in the receptor and capsid that control binding, 
and have determined the 27Å resolution asymmetric structure of the 
dimeric feline TfR ectodomain interacting with the CPV capsid (22)
(Fig. 5)
.  
Here we will define the interactions between specific residues on the 
receptor and capsid in more detail, and will complement the mutational 
studies with higher resolution cryoEM structures of the complexes, so as to 
achieve a complete understanding of the interactions and their control of 
various viral functions. 
C2b1a) Viral mutants to examine.
Some cleavage site and flexibility 
mutants will be derived from Aim 1 by mutation of sites in the capsid 
structure.  Other viruses will have altered affinities of TfR binding or TfR 
contacts.  The CPV-2a natural variant is altered at VP2 residues 87, 101, 
300 and 305 and shows reduced affinity for the feline TfR, but retains high 
infectivity (49).  We have prepared intermediate mutants with single or 
double changes in the capsid (e.g. of VP2 residues Ile101Thr and 
Ala300Gly) that alter the affinity of receptor binding.  VP2 residues 93 and 
323 together control binding to the canine TfR but not the feline receptor 
(20). 
C2b1b)  Selection for viruses with altered binding properties by passaging on mutant receptors.
To identify the 
capsid residues that interact with specific sites on the TfR, we will isolate mutant viruses by growth in CHO 
cells that are expressing TfR variants which show reduced virus binding and infection due to point mutations in 
the apical domain.  We have prepared cell clones that express the altered affinity variants of the feline TfR 
(19). Those will be inoculated with CPV or FPV and then the virus passaged repeatedly to isolate variants that 
are better adapted.  Once isolated those viruses will be sequenced to identify the candidate contacts between 
the receptor and virus that are selected for increased infection.    
C2b1c) TfR variants with increased binding prepared by in vitro evolution and selection.
To alter TfR binding 
we would use yeast surface display and selection to prepare receptor variants with altered capsid-binding 
properties, including those with higher affinities.  Clones of the feline TfR ectodomain and of the apical domain 
alone have been prepared and those are displayed on the surface of yeast as fusions with the Aga2p mating 
agglutinin protein (4, 12).  To select for altered binding variants of the protein, TfR sequences around the apical 
domain would be subjected to error-prone PCR, and then the mutant products transformed into yeast along 
with the expression plasmid to give incorporation by the homologous recombination (4).  The mutant TfR yeast 
library would be selected by capsid binding, and fluorescence-based sorting used to enrich for yeast 
Fig. 5. 
The cryoEM structure 
of the feline TfR in complex 
with the CPV capsid. 
Research Strategy                                                                                             Page 38
Principal Investigator/Program Director (Last, first, middle): Parrish, Colin, R.
JPG to PNG Converter | Convert JPEG to PNG, Convert PNG to JPG
Image Converter Pro - JPEG to PNG Converter. Convert JPEG (JPG) Images to, from PNG Images on Windows.
add photo to pdf preview; how to add a jpg to a pdf
JPG to GIF Converter | Convert JPEG to GIF, Convert GIF to JPG
Converter. Convert JPEG (JPG) Images to, from GIF Images on Windows. JPEG to GIF Converter can directly convert GIF files to JPG files.
how to add a jpeg to a pdf; how to add an image to a pdf
expressing receptors binding higher levels of virus compared to an HA epitope included in the expression 
vector - yeast showing higher virus binding relative to the levels of protein expression would be candidates for 
those with increased affinity.  A BD-Biosciences FACS Aria high speed flow cytometer/cell sorter at Cornell is 
available to the Parrish laboratory, which can sort up to 50,000 events per second, allowing us to enrich for 
even rare mutants with increased binding.  Repeated selection and additional rounds of mutagenesis would be 
used if necessary to isolate the higher binding versions of the receptor.  TfR variants with altered binding would 
be re-introduced into the TfR gene in an expression plasmid, transfected into TRVb cells, and then tested for 
binding affinity and for the ability to mediate infection.  The relative binding and infectivity of each of the three 
major strains of virus would be compared to those seen for the wildtype TfR, or to the lower affinity versions of 
the TfR already produced in other studies (19, 50).   
C2c) Use cryoEM and mutant mapping to obtain better structural models of the CPV-feline TfR and 
canine TfR interactions.
To directly visualize the TfR-capsid interaction we would prepare higher resolution cryoEM reconstructions of 
TfR:capsid complexes, by including more complexes and by using approaches that allow orientation of the 
receptor in the complex. We would examine complexes of the feline and canine TfR ectodomains, as well as a 
canine TfR mutant that has a single point mutation that removes a glycosylation site, which binds with higher 
affinity and which will likely still show the binding of the canine TfR.  Traditional cryoEM approaches can be 
difficult due to the dimeric and the aggregation-prone properties of the TfR ectodomain, and we would avoid 
these problems using a number of approaches.  Data would be collected at Purdue University, where Dr. 
Hafenstein worked for several years until 2009, so that she is familiar with the microscopes and systems 
required for these studies. A letter of support is included from Dr. Paul Chipman, who manages the EM facility 
at Purdue, indicating that Dr. Hafenstein would have access to the appropriate equipment for these studies. 
In one approach we would purify the capsid-TfR complex in a Separose CL2B column to isolate monomeric 
complexes (22), and after concentrating those would be frozen and examined by cryoEM.  An EM defocus 
level of <4 microns is necessary for high resolution reconstructions, but at those defocus levels there can be 
insufficient contrast to easily determine the position of the TfR bound to the capsid.  We would therefore seek 
to increase the TfR density by saturating the TfR with iron-loaded transferrin, which would both double the 
mass of the TfR and add Fe
3+
ions to the complex, allowing better visualization.   
In a second approach we would prepare liposomes containing up to 10% (w/w) DOGS-NTA which would be 
nickel loaded, incubated with soluble 6-His TfR ectodomain, and then with purified virus, and frozen for cryoEM 
(5, 8).  A similar approach would be to use “monolayer purification” (32), where a lipid monolayer containing 2 
to 20% Ni-NTA lipids would be used to bind the TfR ectodomain, followed by incubation with capsids.  That 
monolayer could be picked up on an EM grid and examined by negative staining, or frozen for cryoEM.  The 
latter method has been used to visualize TfR-transferrin complexes and ribosomes (32), giving sufficient 
resolution to define their structures.  An additional advantage of these methods is that they would result in the 
virus-binding apical domain of the TfR orientated away from the lipid surface, and the density of the TfR:capsid 
complex can be adjusted by varying the amount of the Ni-NTA lipid in the membrane.  Using proper controls 
for non-specific capsid binding, this would allow us to ensure that each particle had one or more receptors 
located between the capsid and the membrane layer.   
C2c1) CryoEM reconstruction methods, asymmetric structures.
The methods to be used here for cryoEM 
reconstructions are now well established, including those that do not rely on the standard icosahedral 
averaging methods during reconstruction.  To visualize the feline TfR interacting asymmetrically with CPV, we 
used a reconstruction procedure that was developed at Purdue (22, 35).  The program involved a combination 
of the programs SPIDER (17) and a modified version of XMIPP (62), and utilized the particle orientations found 
in an icosahedral reconstruction of the CPV-feline TfR complex.  A spherical mask is defined that 
corresponded to one icosahedral asymmetric unit, then the area of each of the 60 possible projections of the 
mask is examined to determine the best correlation between the density of the image and the projected density 
of the mask, given the angles that define the virus orientation for each specific difference image.  These 
orientations are used to compute an asymmetric reconstruction.  The procedure is iterated using the resultant 
map to re-select, from the 60 orientational possibilities, the preferred angles that define the TfR position 
relative to the orientation of the virus. In our previous studies, convergence of the particle orientations was 
reached after about six cycles.  To obtain three-dimensional reconstructions of individual virus symmetry 
features, Briggs et al. describe a method of cryoEM reconstruction allowing for the classification and 
reconstruction of individual features of icosahedral virus particle (6).  This allows examination of features that 
Research Strategy                                                                                             Page 39
Principal Investigator/Program Director (Last, first, middle): Parrish, Colin, R.
deviate from perfect icosahedral symmetry, such as a unique vertex or incorporation of proteins with less than 
full occupancy.  
C2d) Can alternative receptor binding ligands in the CPV capsids mediate infection? 
An open question is still whether the TfR binding is required for cell infection because of some structural 
specificity, or whether other receptors would also work.  This would be examined directly by using alternative 
receptors to bind the capsid to cells, and examining the effects on cell entry and infection.  In studies of other 
parvoviruses and AAVs the insertion or replacement of peptides or protein domains into the capsid structures 
has allowed the selection of variants with altered receptor binding and tropisms (11, 44).  We will examine CPV 
variants with a variety of insertions into surface loops that have been shown to allow peptide addition (57).  An 
initial candidate would be the insertion of the integrin-binding peptide Arg-Gly-Asp into the 4 surface loops, 
some of which would be expected to affect the binding to the TfR, while others would be outside the TfR 
binding site, so that they may be able to be grown on normal cells, and tested for infectivity on cells expressing 
other receptors (such as the αvβ5 integrin).  This has been shown to allow some transduction of CPV vectors 
in previous studies (43), and also to work for AAV vectors (18).  Peptides that bind the human TfR have been 
reported (37, 72), and we would insert those sequences into the CPV capsids in the surface loops. Capsids 
would be prepared after transfection and tested for their ability to bind the feline, canine or human TfRs when 
those were expressed on TRVb cells, and to mediate infection. 
We would also use our experience with antibody engineering to prepare bi-specific antibodies that contain the 
binding domains of non-neutralizing anti-capsid Mab as well as those of Mab that we have prepared against 
the feline TfR (3, 50).  Alternatively the anti-TfR scFv itself would be inserted into the capsid structure as an 
additional domain, either into one of the surface loops as has been shown to work for various sized peptides, 
or added to the C- or N-terminus of VP2 as has been reported for AAV vectors (73).   
Each mutant or sequence-inserted capsid would be tested for assembly after transfection, and then for viability 
in feline or canine cells.  Assembling viruses that do not infect and replicate independently would be prepared 
by transfection and the virions purified and concentrated before being used for testing.  Binding of the capsids 
to cells expressing various receptors (or no receptors as controls) would be tested using our standard methods 
of flow cytometry or fluorescence microscopy (19, 24, 26).  The TfR binding peptide- or scFv-expressing 
capsids, or those tested with the bi-specific antibody linker would be inoculated onto cells expressing mutant 
versions of the feline TfR that do not bind capsids [e.g. Ile221Ser (50)].  Infection would be measured by 
staining for virus capsids in cells, or the NS1 protein. 
C2e)  Expected outcomes, possible problems and solutions and alternative approaches. 
The studies to be conducted here extend from our previous work which has largely been published, and we 
expect that most will be straightforward and lead to clear results.  The preparation of mutant and chimeric 
capsids containing peptides would be straightforward, as would be the bi-specific antibody linker.  The results 
are difficult to predict, as it does appear from previous results that the CPV capsid is not as permissive for use 
of alternative ligands as is AAV.  However, by trying several different approaches we believe that we can 
answer the basic question about the structural dependence on TfR binding for infection.   
We do not currently have a way to directly connect capsid mutations with specific structures of the TfR, and so 
we will select for viral variants using TfRs with known changes in their structure, and also to prepare higher 
resolution TfR:capsid complex structures.  While it is not certain that the viral and TfR changes selected will 
necessarily be in direct contact, that is a reasonable possibility, and the residues identified can be used in 
docking and orientation studies of the TfR-capsid complexes.  The higher resolution TfR-capsid structures will 
involve refinements of methods that we have already developed, as well as preparation of purified complexes, 
or of immobilized receptors on lipid layers.  These would increase the quality of the results by reducing the 
background of the images, and where the TfR was immobilized on a monolayer or liposome, its orientation 
relative to the capsid would be constrained to one or a small number of positions in the images collected. We 
can also use tomography with a tilting stage to collect more images of each complex, to obtain additional 
structural information.  
We have several versions of the feline and canine TfRs that bind with lower affinities than the wildtype due to 
single changes in their sequence (19).  The yeast expression technology has been used for many studies 
expressing cell surface glycoproteins [e.g. (28, 33)], and the method is being used in the Parrish laboratory for 
antibody engineering (see also Section C3).  The TfR is a complex protein structure, and it may not fold 
correctly or bind virus efficiently in yeast, and there may be differences in glycosylation.  Despite these 
difficulties if these studies worked they would give us valuable data, and so we see this as a “high risk but high 
Research Strategy                                                                                             Page 40
Principal Investigator/Program Director (Last, first, middle): Parrish, Colin, R.
payoff” experiment, but not essential for the studies - even if the yeast expression does not result in an 
improved receptor, we have many other TfR mutants and capsids with variable properties that will give us most 
of the information we are seeking about the roles of the receptor:capsid interactions in virus infection. 
C3) Aim 3. Use antibodies to probe the capsid structure, and also to determine how binding to 
overlapping sites leads to neutralization in some cases, but not others.
Hypothesis: That antibodies can 
be used to detect variant structures in the viral capsid, and that the specific position and orientation of binding 
controls the likelihood of competition with the TfR, and neutralization of infection.
C3a) Background.
The properties of viral antigens and the effects of antibody binding vary, with some viruses being efficiently 
neutralized, while others show varying degrees of escape from antibody binding or inactivation (23, 54).  The 
parvovirus capsid is a potent multivalent antigen which rapidly stimulates strong antibody responses, and each 
virion can bind up to 60 antibody molecules (21).  We have prepared many different antibodies that recognize 
the CPV capsid, and have recently mapped the binding footprints of 8 separate antibody Fabs on the virion 
surface structure using cryoEM (21).  Those antibodies covered a total of ~70% of the capsid surface, and 
could be divided into two major clusters of overlapping binding sites (termed “A” and “B”) (21, 63).  Several of 
the antibody footprints clearly overlapped the binding footprint of the feline TfR 
(Fig. 6)
. Those antibodies are 
very specific for particular structures in the capsids, and therefore can be used to probe for changes (21, 70).  
While 7 of 8 antibodies bound with similar affinities and overlapped the TfR binding site on the capsids, 4 
showed little neutralization of the virus when tested as Fabs, 
while two showed efficient neutralization (46).  Some 
neutralizing and non-neutralizing Fabs represent pairs with 
essentially the same footprint, indicating that there can be 
distinct interactions between TfR and antibody binding that give 
different effects on viral infection.  One model derived from the 
cryoEM structures is that the angle of attachment is important in 
neutralization, and that Fabs binding at an oblique angle may 
block TfR binding to both the capsid subunit where the Fab 
bound, as well as to an adjacent two-fold related asymmetric 
unit (21)
(Fig. 7)
.  Competition between the Fabs and the feline 
TfR was much more efficient for the highly neutralizing Fabs 
suggesting that those had a different mechanism of blocking 
receptor attachment (46).  While other possibilities such as 
differences in the affinity of binding of the neutralizing and non-
neutralizing Fabs seem unlikely due to the similar affinities of 
most of the antibodies examined, we will also be able to test that 
possibility directly in the studies proposed by selecting for 
increased affinity variants (see below).    
C3b) Antibody and TfR binding – uneven Fab binding and examining for unoccupied sites. 
The poor neutralization by several antibody 
Fabs indicates that even in the presence of 
excess Fab (when all 60 capsid sites appear 
occupied by cryoEM), there are still sites on the 
capsids available for receptor binding.  As 
described above, cleaved VP2 surface loops 
would likely form such open sites, as they are 
unlikely to allow antibody attachment, but those 
may still allow (or perhaps even favor) TfR 
binding.  Such a mechanism would explain why 
Fabs that bind at oblique angles could sterically 
block TfR access to an adjoining cleaved site on 
the capsid which did not directly bind that 
antibody.  Here we would use the capsids with 
either varying numbers of cleavages or different 
levels of cleavage susceptibility to examine for 
effects on antibody and TfR binding. 
Fig. 6. 
Binding footprints on one 
asymmetric unit of the CPV capsid, 
showing a B-site antibody (blue), an 
A-site antibody (red), and of the feline 
TfR (black).  Residues 297 and 300 
control protease cleavages. 
Fig. 7.
The cryoEM structures of the complexes 
between the Fab of Mab F (neutralizing) and Mab8 
(largely non-neutralizing as Fab), showing the different 
orientations of those Fabs, which otherwise bind with 
similar footprints on the capsid. 
Research Strategy                                                                                             Page 41
Principal Investigator/Program Director (Last, first, middle): Parrish, Colin, R.
C3b1a) TfR binding to Fab-occupied capsids.
To test this model, we would examine for such open sites on the 
capsids using viruses with alterations in capsid cleavages (derived in Section C1 studies).  Mutant or wildtype 
capsids would be digested with proteinases to cleave varying proportions of the surface loop around VP2 
residue 300.  After purification, those capsids would be incubated with excess Fab, and then with purified TfR 
labeled with 5 nm colloidal gold.  After washing, the complexes would be examined in the EM either unstained 
or with light negative staining, looking for capsid-associated gold particles, compared to control capsids, or 
those incubated with labeled TfR in the presence of non-specific Fabs. A prediction of our hypothesis is that 
most Fabs would allow some TfR binding, but that binding would be blocked by the highly neutralizing Fabs of 
antibodies E and F.   
C3b1b) Are there open sites on Fab-saturated capsids that can be detected with antibodies of different 
specificities?
Open sites on capsids incubated with excess Fab would also be assayed by leaving the Fab with 
the capsids in large excess, and incubating with gold labeled Fabs of antibodies binding to different regions of 
the viral asymmetric unit.  For example, cleavages around VP2 residue 300 would likely prevent the B-site 
antibodies from binding, while most A-site specific Fabs would still bind to those digested capsid subunits. As 
some A-site antibodies (e.g. shown in red in 
Fig. 6
) clearly overlap the binding footprints of some B-site Fabs 
(as shown in blue in 
Fig. 6
) (21), they could be used as specific probes for the open sites not occupied by the 
B-site Fabs.  For these assays controls are critical to distinguish possible artifacts.  One would be provided by 
the comparison of the antibodies with different effects on receptor binding.  The possibility that the second 
antibody binds due to the natural exchange due to low affinity of the different antibodies would be examined by 
swapping the two antibodies in the study (gold labeling the first antibody and adding excess second antibody), 
or by using antibody variants with increased affinities selected as described below. 
C3b1c) Detecting low levels of open sites by precipitating capsids with biotinylated antibodies.
An additional 
assay for open sites would be to use biotinylated Fabs or TfR, and to incubate those with the Fab:capsid 
complexes in the presence of excess unlabeled Fab.  We would then precipitate the biotinylated protein in the 
complex with streptavidin beads, or would precipitate the TfR with an anti-TfR monoclonal antibody we have 
prepared (50). The amount of capsid precipitated would be determined by Western blotting.  This would show 
the proportion of capsids with sites that were accessible to the probe in question, even if present at low levels 
or transiently.   
C3c) Is the affinity of the antibodies important for the TfR competition and neutralization? 
An alternative mechanism would be that neutralization is related to the specific affinity of the antibody, with 
increased affinity allowing a more efficient blocking of viral functions - such as receptor binding or capsid 
trafficking and specific structural changes in the endosome.  We could test this by preparing antibody domains 
with higher and lower affinities and testing their abilities to neutralize the virus as scFv or Fabs.  We have 
cloned the light and heavy variable chains of several antibodies and expressed those domains in yeast, as 
described for TfR (Section C2b1c).  We would initially concentrate on neutralizing:non-neutralizing pairs of 
antibodies that bind to essentially the same sites, but that differ in neutralization - such as antibodies F and 8 
(21).  Initial studies show that the initial set of 4 antibodies that we have expressed are produced in good 
amounts on the surface of yeast cells, and that they show functional capsid binding when expressed (e.g. 
Fig 
8
).  Those antibody V
H
and V
L
domains would therefore be readily mutated by error prone PCR and then 
introduced back into the yeast 
to allow recombination, 
producing a library that can be 
selected for altered (generally 
higher) affinity forms (9).  We 
have already produced such a 
library for the clone of antibody 
8 in yeast, and started to select 
for higher affinity versions.  
Antibodies selected would be 
expressed as either scFvs, or 
linked to the heavy and light 
chain constant regions to 
produce Fabs (71), and tested 
for binding affinity and for 
Fig. 8.
The functional antibody scFv expression on the surface of yeast, 
t, 
where expression was detected with an anti-Fab antibody staining, and 
the binding activity detected using Alexa-fluor labeled capsids.  Three 
examples are shown for of the antibodies to be examined here. 
Research Strategy                                                                                             Page 42
Principal Investigator/Program Director (Last, first, middle): Parrish, Colin, R.
neutralization using standard methods (46).  The affinities of binding can be directly measured for the antibody 
expressed on the yeast surface using flow cytometry to estimate on- and off-rates (9, 67). 
An additional variant on this protein engineering approach would involve determining the virus-specific contacts 
and specificity determinants of the antibodies.  We have already solved the X-ray crystal structure of the Mab 
14, which specifically binds CPV but not FPV (21).  Other specific antibodies do not recognize certain natural 
or antibody-selected antigenic variants (escape mutants) of the capsid (63).  We would therefore use the same 
yeast expression library and mutagenesis to select antibody mutants that recognize those variant capsids, and 
thereby determine the antibody structural determinants of site-specific recognition.  This would allow better 
models of the antibody-capsid contacts to be obtained. 
C3c1) Functional testing of the mutated antibodies.
To determine the effects of the different changes in the 
capsids and antibodies on the process of infection and the relationship to neutralization, we would examine the 
effects of the purified antibodies or antibody domains (as scFv or Fab) on the viral functions.  We would purify 
the wild type and mutant forms of the capsids and antibodies.  Antibodies would be tested for their ability to 
compete with TfR in binding assays, and for their ability to neutralize standard virus preparations.  Wildtype or 
mutant capsids would also be used, and treated with proteases to cleave varying proportions of the VP2 in 
some studies.  Those would then be examined for their ability to bind the TfR in solid phase or on cells, for 
uptake into the normal pathways of cell entry, or to be neutralized, using our well established methods (24, 46). 
C3d) Expected outcomes, potential problems and their solutions or alternative approaches. 
These studies will use existing well-characterized antibodies and engineered variable domains to answer 
important questions about the mechanisms of antibody attachment, recognition of specific capsid structures, 
and their interactions with receptor binding leading to neutralization.  We already have the antibody-capsid 
complex structures of a representative set of 8 antibodies (21), and have several of the antibodies expressed 
in either bacteria or yeast and have confirmed that those are expressed and bind the viral capsids (e.g. Fig. 8). 
We are therefore well positioned to carry out the studies proposed.   
While the lack of binding by some of the antibodies to sites with cleaved loops has not been formally shown, 
that is highly likely given the properties of the known escape mutations and binding sites.  The preparation of 
the gold-labeled Fabs should be quite straightforward, while the TfR labeling may be more challenging.  
However, the TfR ectodomain dimer, as expressed, displays two 6-His tags on the underside of the receptor, 
and that should be readily labeled by Ni
2+
-gold conjugates.  The selection for antibody domains with altered 
affinities should be straightforward given that we already know that the most interesting antibody pairs are 
expressed in a functional form on the surface of yeast, and our close collaborator, Dr. Moonsoo Jin, has used 
all of the methods proposed for preparing and screening mutant libraries for ligands with altered affinities (see 
letter of collaboration).
C4) Overall Summary and Conclusions.
These studies will integrate our understanding of the structures of viral capsids with a more detailed knowledge 
of the binding properties and functions of host cell receptors and antibodies.  The results would be correlated 
with biochemical and structural analyses of the capsid flexibility, variation, and/or asymmetry.  These are 
central questions that apply to any non-enveloped animal virus, and have parallels to the structural changes 
and interactions seen for many enveloped virus glycoproteins, and so the results will clarify some of the 
underlying rules about how viruses interact with their host ligands and infect cells.   
The work builds on a solid intellectual and methodological foundation resulting from our previous studies, and 
we have most of the materials and background information required.  For each of the projects we combine well 
established methods with new approaches, and have alternative approaches for each of the experiments 
where the technology is novel or untested.  Studies already underway would be continued in the first phase of 
the funding period, while studies requiring the development of reagents or information from previous studies 
will be done later in the project. 
TIMELINE 
This project would take 5 years to complete.  The sequence of studies will initiate in years 1 and 2 with the 
preparation of the capsid mutants and their testing, along with development of the new methods for sample 
preparation for cryoEM, and collection of the cryoEM data for analysis.  Analysis of the role of cleaved and 
stabilized capsids would initiate with the currently available mutants, and continue through years 3 and 4.  
Mutant forms of the TfR and antibodies would be prepared in the first years, and tested in later years up to 
year 5.  The preparation of capsids with altered receptor binding sites (peptides or domains), and selected on 
mutant receptors, would occur during years 3 to 5.   
Research Strategy                                                                                             Page 43
Principal Investigator/Program Director (Last, first, middle): Parrish, Colin, R.
Documents you may be interested
Documents you may be interested